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1背景与目的胃癌是全球高发且最常见的癌症之一,在全球癌症相关死亡中排名第二。尽管世界在诊断和治疗癌症方面取得了重大进展,但估计胃癌相关的死亡率在将来会继续增加。因此,迫切需要识别可用于预测预后和阐明潜在分子机制的新型生物标志物。近年来,异常肿瘤细胞周期和分化在恶性肿瘤的维持中起着决定性的作用,靶向癌细胞的周期和分化被认为是治疗癌症的新靶点。相关基因的改变将会引起细胞周期失控、超常运行进而导致肿瘤的发生。近年来对细胞周期调控基因、细胞分化与癌症发生之间关系的研究,日渐成为焦点。CDK2和CDX2参与细胞周期及细胞分化的调控,虽然细胞分化和细胞周期的调控是两个独立的进程,但他们密切相关,因为细胞周期停滞是进行终末分化的先决条件,两者之间的转变在细胞生长过程中发挥着重要作用。本章节观察构建好的慢病毒载体转染后的胃癌细胞,对转染后的胃癌细胞系的细胞周期、细胞凋亡、细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力的影响。明确目的CDK2、CDX2和CDK2-CDX2(OE)对胃癌肿瘤细胞的生物学效应。应用Western Blot蛋白印迹和RT-PCR实验检测目的靶基因及其下游基因在mRNA水平及蛋白功能水平的改变,并对目的CDK2靶基因和CDX2靶基因的表达水平和功能水平进行相关性分析,进一步明确CDK2和CDX2目的在胃癌中周期和分化时的作用机制。CDK2是一种细胞周期依赖性激酶,通常调控细胞周期进展,DNA损伤反应,据报道在许多癌症中上调。然而,它在癌细胞代谢中的作用却很少被讨论。在本研究中,我们证明沉默CDK2抑制了胃癌细胞系的有氧糖酵解能力。机制探索表明沉默CDK2可以增加SIRT5表达的抑癌基因。最后,在胃癌细胞中研究SIRT5在增殖和糖酵解过程中的生理作用。综上所述,本研究揭示了CDK2/SIRT5轴在胃癌中的新作用,并阐明了胃癌细胞代谢的未来研究方向。本研究拟通过iTRAQ技术筛选差异蛋白,通过构建慢病毒载体并转染胃癌细胞建立稳定细胞株,并通过荧光定量PCR方法检测在胃癌细胞株过表达的表达情况。观察目的基因在体内外对胃癌肿瘤细胞的功能作用,利用实时定量PCR和Western Blot蛋白印迹实验检测靶基因。利用集落细胞形成实验和细胞凋亡检测技术探讨CDK2对胃癌细胞的有氧糖酵解的影响。通过细胞外酸化率(ECAR)测定细胞糖酵解能力。用氧耗率(OCR)测定线粒体呼吸能力。明确目的CDK2、CDX2及SIRT5在胃癌发生发展中的相互关系,阐明CDK2在胃癌发生发展中的功能和作用机制。2方法2.1基于iTRAQ技术转染过表达及沉默表达CDK2的胃癌细胞筛选差异蛋白进行鉴定及验证。应用细胞裂解液提取转染过表达及沉默表达CDK2的胃癌细胞,并测定蛋白浓度。通过蛋白的酶解进行液相色谱质谱联用分析,标记肽段和除盐处理,在标记肽段的高PH反相液相色谱分离,最后进行质谱检测。通过蛋白质定性和定量分析,在Proteome Discoverer软件(PD)中输入质谱图后,系统开始筛选质谱谱图。定量定性通过Mascot搜库,在取得质谱图后再次用mascot搜库进行查询,在查询结束后,根据mascot的搜索结果进行定量分析。2.2构建包含目的CDK2、CDX2、CK2-CDX2、SIRT5过表达目的荧光慢病毒载体,构建包含目的沉默CDK2表达的荧光慢病毒载体。提取阳性细胞进行重组克隆,克隆后提取质粒进行测序验证。收集重组过表达CDK2、CDX2、CK2-CDX2、SIRT5目的病毒颗粒,收集重组表达沉默CDK2的目的病毒颗粒;转染构建的病毒载体,成功获得MGC-823-CDK2、MGC-823-CDX2和MGC-823-CDK2-CDX2(或者称为MGC-823-OE组),并构建成功MGC-823-NC作为阴性对照组;转染MGC803和SGC7901成功获得沉默CDK2(siRNA),同样的方法转染MGC803和SGC7901成功获得过表达CDK2组和SIRT5组,并分别构建阴性对照组。通过嘌呤霉素筛选过表达胃癌稳定细胞株和沉默表达组,荧光定量PCR检测转染细胞株CDK2、CDX2、CK2-CDX2、SIRT5的mRAN表达,也检测沉默CDK2的mRNA表达。2.3 CCK-8检测法检测CDK2、CDX2和CK2-CDX2对胃癌细胞增殖能力的影响;Transwell法实验检测CDK2、CDX2和CK2-CDX2对胃癌细胞迁移侵袭能力的影响,鉴定不同胃癌细胞的迁移和侵袭能力;流式细胞术检测CDK2、CDX2和CK2-CDX2对胃癌细胞周期和凋亡的影响;通过荧光定量PCR测定MGC-823-CDK2、MGC-823-CDX2、MGC-823-CDK2-CDX2及MGC-823-NC中mRNA的表达量;通过Western blot检测MGC-823-CDK2、MGC-823-CDX2、MGC-823-CDK2-CDX2及MGC-823-NC的蛋白表达量。构建人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,在裸鼠左侧腋窝皮下注射转染后稳定株的细胞悬液200ul(7×10~6个/ml),每三天测一次,用相对瘤体体积RTV(TV=1/2×肿瘤体长径(a)×短径(b)~2),并根据测量后计算的数据绘制肿瘤生长曲线。颈椎脱臼法将裸鼠处死(3周后),用HE染色完整切取肿瘤组织并确认肿瘤组织,再用CDX2和CDK2抗体行免疫组化测定肿瘤中CDX2和CDK2表达量;构建裸鼠胃癌转移模型,即用转染好的稳定细胞株悬液200ul(7×10~6个/ml)在裸鼠尾静脉注射入,颈椎脱臼法将裸鼠处死(5周),将裸鼠肝脏组织和肺组织完整切取,胃癌肝肺转移情况用HE染色检测。2.4构建沉默CDK2表达和CDK2、SIRT5过表达的病毒载体,转染到SCG-7901和MGC803细胞上并建立稳定株;应用定量PCP检测稳定株的mRNA量;应用western blot检测稳定株的蛋白量;通过CCK-8试剂进行细胞增值测定;应用集落形成实验检测SIRT5过表达组细胞克隆情况;应用流式细胞实验检测SIRT5过表达组细胞凋亡情况;用海马(seahorse)系列的细胞能量代谢检测仪并细胞凋亡检测试剂盒对沉默CDK2和CDK2、SIRT5过表达对胃癌细胞有氧糖酵解及磷酸化进行氧消化量(OCR)和细胞外酸化速率(ECAR,间接显示糖酵解能力)的检测。3.结果3.1通过iTRAQ技术筛选出的差异性蛋白有:鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G,亲尾蛋白,72kDaⅣ型胶原酶,泛素羧基末端水解酶38等11个基因。通过Gene Ontology的数据分析,结果发现我们筛选得到的蛋白中,未折叠蛋白反应及其相关的多条通路中,多次出现有意义的情况。结果显示:0004674蛋白质的丝氨酸/苏氨酸激酶、0045095角蛋白丝、0005882中间丝、0045111中间丝细胞骨架、0043232细胞内非膜界细胞器、0043228非膜界细胞器两组基因组差异表达最大。通过差异蛋白互作网络的构建,发现CDK2在差异蛋白量表达最大。而通过Pathway分析方法,发现自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、自身免疫性甲状腺疾病、抗原加工与提呈三条通路相关性最大。提示CDK2与胃癌细胞的形态维持、分化及免疫等生物学行为密切相关。3.2通过荧光定量PCR和western blot检测显示:已经成功构建CDK2、CDX2、CDK2-CDX2和SIRT5过表达慢病毒载体和沉默CDK2表达慢病毒载体;CDK2、CDX2、CDK2-CDX2和SIRT5过表达胃癌细胞株构建成功,可用于下一步实验;沉默CDK2表达胃癌细胞株构建成功,可用于下一步实验。3.3将CCK-8实验检测结果显示与阴性对照组相比,提示MGC-823-OE、MGC-823-CDX2细胞增殖能力明显降低;MGC-823-CDK2细胞增殖能力明显增强(P﹤0.05);将Transwell实验检测结果显示与阴性对照组相比,提示MGC823-CDK2细胞迁移和侵袭能力较强,MGC823-OE细胞迁移和侵袭能力较MGC823-CDX2较弱(P<0.05);MGC823-CDX2细胞迁移和侵袭和MGC823-NC、MGC-823-OE更弱(P<0.05);将流式细胞仪检测结果显示与阴性对照组相比,提示CDX2和OE过表达的实验组胃癌细胞株MGC-823的细胞周期阻滞在G0/G1期,S期细胞比例显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。CDK2过表达的实验组胃癌细胞株MGC-823的细胞周期在G0/G1期明显减少,S期细胞比例显著增多(P<0.05);MGC823-CDK2细胞凋亡率减少,MGC823-CDX2和MGC823-OE细胞凋亡率增加(P<0.05);将荧光定量PCR实验结果表明与阴性对照组比较,提示实验组靶基MGC823-CDK2因CDKN1A、TP53I3、Rock1的mRNA表达增加(P<0.05),实验组靶基MGC823-CDX2、MGC-OE的CDKN1A、TP53I3、Rock1的mRNA表达增加(P<0.05);将western blot实验结果表明与阴性对照组比较,提示实验组MGC823CDK2蛋白表达增加,MGC823CDX2和MGC823OE组蛋白表达减少(P<0.05)。将裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤体积测量的结果显示与阴性对照组相比,提示MGC-823-CDX2和MGC-823-OE组过表达的实验组胃癌细胞株的裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤体积较小(P﹤0.05),MGC-823-CDK2组过表达的实验组胃癌细胞株的裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤体积较大(P﹤0.05);将HE染色确认皮下移植瘤组织为恶性胃癌组织与阴性对照组相比,提示MGC-823-CDK2组的皮下移植瘤组织的CDK2表达率明显增高(P<0.05);MGC-823-CDX2和MGC-823-OE组的皮下移植瘤组织的CDK2表达率明显降低(P<0.05);MGC-823-CDX2组的皮下移植瘤组织的CDX2表达率明显降低(P<0.05);MGC-823-CDX2和MGC-823-OE组的皮下移植瘤组织的CDK2表达率明显增高(P<0.05)。转移瘤模型的肝肺组织病理检查结果显示,MGC-823-CDX2过表达组细胞肝转移能力明显降低(P﹤0.05);MGC-823-CDK2过表达组细胞肝转移能力明显增强(P﹤0.05)。3.4 CDK2对胃癌细胞的有氧糖酵解有积极的调节作用:沉默CDK2表达显著抑制ECAR水平,表明CDK2是有氧糖酵解的正调控因子,在CDK2沉默的SGC-7901和MGC-803细胞中,结果显示CDK2在有氧糖酵解重组中的积极作用,有氧糖酵解基因GLUT1、HK2、LDHA和PDK1在定量实时PCR结果表明,CDK2的敲除导致这些基因的表达减少(P﹤0.05)。CDK2对胃癌细胞的SIRT5表达呈负调控:定量PCR结果表明,CDK2降低了SGC-7901和MGC-803细胞mRNA水平的SIRT5表达(P﹤0.05)。免疫印迹结果显示,CDK2的表达降低了SGC-7901和MGC-803细胞中蛋白水平的SIRT5(P﹤0.05);SIRT5抑制胃癌细胞增殖:CCK-8细胞活力测定,结果表明SIRT5对胃癌细胞的细胞活性呈负调控(P﹤0.05);克隆形成实验:SIRT5在SGC-7901和MGC-803细胞上的表达能力减弱(P﹤0.05),SIRT5的过度表达增加了SGC-7901和MGC-803细胞的凋亡(P﹤0.05);SIRT5抑制胃癌细胞的有氧糖酵解:SIRT5对糖酵解基因表达情况的影响,包括GLUT1、HK2、LDHA和PDK1。实时PCR结果表明,SIRT5进入SGC-7901和MGC-803细胞,降低了糖酵解基因的表达状态(P﹤0.05);SIRT5抑制胃癌细胞的肿瘤形成能力:生长曲线测量显示SIRT5过表达抑制SGC-7901细胞的肿瘤形成能力(P﹤0.05);SIRT5过表达抑制了SGC-7901型肿瘤的肿瘤体积和肿瘤重量(P﹤0.05);4结论4.1通过iTRAQ技术筛选差异蛋白互作网络构建,发现CDK2在差异蛋白量表达最大。而进行Pathway分析方法,发现CDK2与胃癌细胞的形态维持、分化及免疫等生物学行为密切相关。4.2通过荧光定量PCR和western blot检测显示:已经成功构建CDK2、CDX2、CDK2-CDX2和SIRT5过表达胃癌细胞株和沉默CDK2表达胃癌细胞株。4.3 CDK2对胃癌细胞有正调节作用,CDX2对胃癌有负调节作用,双转过表达OE对胃癌细胞有负调节作用,在细胞功能实验和机制实验中都得到了证实;在CDK2过表达组CDX2的表达量明显下调,在CDX2过表达组CDK2的表达量明显下调,提示CDK2和CDX2在细胞周期和分化过程中存在相互调控,为肿瘤靶基因治疗提供新的靶点。4.4将裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤结果显示与阴性对照组相比,提示MGC-823-CDX2和MGC-823-OE组过表达组胃癌细胞株抑制裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤生长,MGC-823-CDK2组过表达的实验组胃癌细胞株促进裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤生长。4.5 CDK2对胃癌的有氧糖酵解有积极的正调节作用,CDK2对胃癌细胞的SIRT5表达呈负调控,SIRT5抑制胃癌细胞增殖,SIRT5抑制胃癌细胞的有氧糖酵解,SIRT5抑制胃癌细胞的肿瘤形成能力。揭示了CDK2/SIRT5轴在胃癌中的新作用,并阐明了胃癌细胞代谢的未来研究方向。创新点1基于iTRAQ技术在转染过表达及沉默表达CDK2的胃癌细胞筛选差异蛋白进行鉴定和验证,通过互作网络构建发现CDK2在差异蛋白量表达最大,通过Pathway分析方法,发现CDK2与胃癌细胞的形态维持、分化及免疫等生物学行为密切相关。2基于细胞功能实验、机制实验和动物实验提示CDK2和CDX2对胃癌细胞的周期和分化机制存在相互作用的机制。即CDK2和CDX2在细胞周期和分化过程存在相互调控,为肿瘤靶基因治疗提供新的靶点。3线粒体沉默信息调节因子SIRT5可能是CDK2在有氧糖酵解调控中的下游效应,SIRT5在细胞增殖和糖酵解过程中起负作用,CDK2通过抑制SIRT5的表达,抑制了有氧糖酵解的负调控,从而对有氧糖酵解进行了积极的调节。揭示CDK2/SIRT5轴在胃癌中的新作用,阐明了胃癌细胞代谢的未来研究方向。