论文部分内容阅读
单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria Monocytogenes，LM)是李斯特氏菌属的重要成员，属于细胞内寄生的革兰氏阳性杆菌。该菌也是一种重要的人畜共患食源性疾病的病原菌，具有重要的公共卫生意义。
为了了解广州地区农贸市场、超市和家禽屠宰加工厂的禽类产品中LM污染的状况，本研究从部分农贸市场、超市及家禽屠宰加工厂共采集了960份各种禽类产品样品，采用了常规的检查方法分离李斯特氏菌，通过生化反应、BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定系统和API IAsteria的LM快速鉴定试剂条，对疑似的阳性李斯特氏菌进行LM鉴定。结果显示：本研究在采集的960份样品中，共分离出36株李斯特氏菌，阳性检出率3.75％；其中LM有6株，分离率0.67％。
本研究进一步对分离到的6株LM进行了药敏实验、pH值的适应范围、对动物的致病性等生物学特性的研究。结果表明此6株LM分离株对先锋必、氯霉素、卡那霉素、先锋V、庆大霉素等多种药物敏感；对环丙沙星、痢特灵、头孢孟多中度敏感；对多粘菌素B、复方新诺明，新生霉素耐药。LM分离株在pH 3.8-10.5范围内可存活。以10<9>CFU/只的剂量通过腹腔注射途径感染SPF级BABL/c小鼠，对小鼠的致死率为100％；以同样剂量对清洁级新西兰兔进行滴眼，可引起结膜炎等症状；但以同样剂量对健康粤黄鸡翼下肌肉注射，未见鸡有任何临床症状。对6株LM分离株的毒力相关溶血素(Hly)基因进行克隆测序分析后发现，所有分离株的Hly基因序列大小均为1590bp，编码529个氨基酸组成的多肽，他们与国内标准参考株C53005、C53003及与GenBank上登录的分离株DQ054589、DQ844148、EF182456的Hly基因有很高的同源性，达到96.1％-100％。
本研究针对LM溶血素(Hly)基因和内化素(InlA)基因保守的区域，自行设计两对特异性引物Hlyl-L/Hlyl-U和InlA-L/InlA-U，建立了相应的二重PCR检测方法，并以LM标准株和6株LM分离株为材料，对该方法进行了灵敏度、通用性、特异性等实验，结果表明该方法最低可检出浓度为10<4>CFU/mL的LM。LM可以同时扩增出大小为744bp和520bp的两条特异性条带，对大肠杆菌、沙门氏菌等食品卫生中常见致病菌和英诺克李斯特氏菌均不能扩增出任何条带。表现出较强的特异性，本研究进一步针对LM的Hly基因设计另一对特异性引物Hly3/Hly4，以标准株C53005为模板，通过PCR方法扩增出不含信号肽的Hly基因片段，然后将其定向克隆原核表达载体pET-28a(+)中，并获得重组表达质粒pET-sHly。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)，并用IPTG(1.0mmol/L)诱导后，经SDS-PAGE分析，最终获得大小约为60kU的表达产物。通过Westem-blotting检测，表达蛋白能与兔的LM阳性血清发生特异性反应，说明该蛋白具有良好的反应性。