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目前华中师大实验小组已经证明,在紫外线照射或杆状病毒诱导的昆虫细胞凋亡中,cytc从线粒体释放到细胞质中,提示了与哺乳动物细胞的凋亡相同,这表明线粒体在昆虫细胞凋亡中也具有重要作用。作为生物学、遗传学和发育生物学模式昆虫之一的家蚕,其细胞凋亡研究尚处于初始阶段,是否存在线粒体途径仍然未知。本研究以家蚕卵巢细胞BmN-SWU1细胞为实验材料,对紫外线诱导的细胞凋亡进行了初步的研究,获得了以下研究结果。
1 Bmcytc基因克隆与信息分析本实验成功克隆了家蚕Bmcytc基因,cDNA长为570bp,ORF长324bp(ORF:84-407),编码108个氨基酸残基,预测分子量为11.7 kD。通过结构域预测,编码蛋白含有一个典型的cytc结构域。通过多序列比对显示,与NCBI登录的人、大鼠和果蝇(cytc-d和cytc-p)的蛋白序列相似性分别为75%,83%,75%和88%。基冈组序列分析结果显示Bmcytc基因具有4个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。参与凋亡时与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)相互作用的关键位点在家蚕细胞色素C中是基本保守的。
2 UVC诱导家蚕BmN-SWU1细胞凋亡UVC处理家蚕BmN-SWU1细胞后,可诱导BmN-SWU1细胞产生典型细胞凋亡。光镜下可见细胞膜表面突出或形成小泡,细胞破裂成凋亡小体。UVC处理24h后,细胞几乎全部破裂成凋亡小体。Hoechest33258染色显示感染细胞核逐渐形交,直至破裂成小块而被凋亡小体包裹。BmN-SWU1细胞处理后DNA琼脂糖凝胶电泳成典型凋亡细胞DNA梯形电泳谱带。
3 UVC诱导家蚕BmN-SWU1细胞凋亡时细胞内线粒体变化流式细胞仪对线粒体膜电位进行检测,结果表明,细胞经罗丹明(Rho-123)染色后在流式细胞仪上检测,UVC处理后12h的BmN-SWU1细胞中,膜电位下降的细胞明显增多,荧光峰左移,即朝荧光强度减少的方向移动,说明此时膜电位下降。Western Blotting检测蛋白cytc在细胞质和线粒体中的含量,结果显示BmN-SWU1细胞在处理后12h线粒体中的cytc被释放到了细胞质中,这与很多在哺乳动物中所作的结果相同。