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木霉菌（Trichoderma sp.）是国际上公认的生物防治微生物，在植物真菌病害的生物防治中具有广泛的应用。木霉菌生防作用的主要机制之一是产生一系列的细胞壁降解酶（Cell-wall Degrading Enzymes,CWDEs）降解植物病原真菌的细胞壁，促进木霉菌对病原真菌的重寄生作用,其中几丁质酶是主要的降解酶类之一。无论是植物病原真菌的细胞壁，还是昆虫体壁及围食膜，几丁质都为重要的组成成分。因此，通过基因工程方法，丰富木霉菌几丁质酶谱、提高其活性，对于协同防治在同时空发生的植物病虫害具有重要理论和应用价值。本研究以靶标害虫亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis(Guenée)）为研究对象，分析了转绿僵菌（Metarhizium anisopliae）几丁质酶基因（chit42）木霉菌工程菌对亚洲玉米螟的杀虫活性，研究了转基因木霉菌对亚洲玉米螟发育相关基因表达和中肠微生态种群结构的影响，为筛选转chit42基因木霉工程菌作用玉米螟中肠细胞的靶标、揭示杀虫机理奠定理论基础。 为了明确转chit42基因木霉菌对非靶标昆虫的影响，以鳞翅目模式昆虫家蚕（Bombyx mori）为研究对象，研究了家蚕应答转基因木霉菌对中肠蛋白质组学变化，明确差异表达蛋白与家蚕应答木霉菌胁迫的关系，为鉴定转基因木霉菌对鳞翅目类昆虫的作用靶标以及为转基因木霉菌生物安全性评价提供理论依据。 主要研究内容如下： 1、转绿僵菌chit42基因木霉菌工程菌的构建及功能分析 同源克隆获得金龟子绿僵菌（M.anisopliae）CY1几丁质酶基因chit42，通过农杆菌介导（ATMT）的转化方法将绿僵菌chit42基因在木霉菌中过表达，RT-PCR测定了外源基因在转录水平上的表达，筛选几丁质酶酶活最高的木霉菌转化子TMC42-11，测定了TMC42-11转化子的几丁质酶发酵液和孢悬液对亚洲玉米螟的校正死亡率，发现几丁质酶发酵液的杀虫效果要高于孢悬液，与野生康宁木霉菌（Trichoderma koningi）T30相比，转基因木霉菌对玉米螟的校正死亡率提高6倍，同源克隆获得玉米螟中肠保幼二醇激酶基因（jhdk）、氨肽酶N基因（apn）及类细胞色素P450基因，转基因木霉菌处理后，三种基因转录水平上的表达受到抑制；外源基因的导入未影响木霉菌对轮枝镰孢菌（Fusarium verticilloides）的抑制。在绿僵菌chit42基因去掉其终止密码子后在基因C端融合了一段eGFP序列，同时绿僵菌chit42基因前18个氨基酸的信号肽序列被替换成木霉菌chit42基因的信号肽序列，过表达框通过ATMT技术导入木霉菌基因组中，荧光显微镜观察菌丝体绿色荧光蛋白的表达，并利用RT-PCR技术验证外源导入eGFP的表达。 2、融合几丁质酶几丁质结合域（chitin-binding domain,chBD）绿僵菌chit42基因木霉菌工程菌构建及功能分析 选择的5种不同来源的chBD为：家蚕几丁质酶几丁质结合域（BmchBD）、云杉蚜虫（Choristoneura fumiferana）几丁质酶几丁质结合域（CfchBD）、果蝇（Drosophila melanogaster）几丁质酶几丁质结合域（DmchBD）、苦瓜（Momordica charantia）几丁质酶几丁质结合域（McchBD）及环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）几丁质酶几丁质结合域（BcchBD）。将这5种chBD与去掉终止密码子的绿僵菌chit42基因在C端融合，构建融合几丁质酶过表达框，通过ATMT技术将融合几丁质酶过表达框导入木霉菌基因组中，RT-PCR验证融合几丁质酶基因的表达，几丁质结合域融合后均能够提高木霉菌转化子的几丁质酶酶活，其中酶活最高的为chit42基因融合McchBD的木霉菌转化子Mc4，Mc4几丁质酶发酵液处理喂食人工饲料后，玉米螟死亡率较未融合转化子Mchit3提高10％，较野生株T30提高了30%；转化子处理喂食48h后，玉米螟中肠微绒毛及杯状细胞微绒毛出现脱落；融合几丁质酶基因木霉菌转化子Mc4对轮枝镰孢菌和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的抑制性高于非融合几丁质酶基因转化子及野生菌；同源克隆获得玉米螟中肠几丁质酶基因，喂食Mc4处理、Mchit3处理及T30处理人工饲料后，玉米螟中肠几丁质酶基因在RNA水平上的表达未表现显著差异。离体条件下在玉米果穗上接种禾谷镰孢菌和玉米螟幼虫，与野生株T30相比，工程株Mc4表现出了更好的防治效果。 3、木霉菌工程菌对亚洲玉米螟中肠微生态的影响及与玉米螟致死率的关系 昆虫中肠微生态平衡对于昆虫正常生长发育至关重要。研究转基因木霉菌对玉米螟中肠微生态的影响，对于揭示转外源chit42基因木霉菌杀玉米螟的微生态学机理、筛选新的作用靶标具有重要意义。结果表明，肠球菌（Enterococcus）、苍白杆菌（Ochrobactrum）及无色杆菌（Achromobacter）为玉米螟中肠优势菌群，分属于变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes），其他非优势菌群包括：土壤杆菌属（Agrobacterium）及鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）。喂食转chit42基因木霉工程菌处理的人工饲料后，玉米螟中肠微生态组成发生显著变化，主要表现在肠球菌数量的上升，增加的肠球菌占据了中肠的生态位使得苍白杆菌数量显著下降，另外，转chit42基因木霉菌处理后玉米螟中肠微生态多样性指数包括香农指数（Shannon-Wiener(H)）和辛普森指数（Simpson(1-D)）是最低的。为了明确肠球菌数量上升对玉米螟死亡率的影响，利用肠球菌筛选培养基将中肠肠球菌进行了分离鉴定，制备含肠球菌人工饲料，喂食或者注射玉米螟2龄幼虫，结果表明：中肠内肠球菌数量的增加与玉米螟死亡率上升呈正相关。 4、家蚕应答转chit42木霉菌工程菌胁迫中肠蛋白质组学分析 为了分析转chit42木霉菌对非靶标昆虫的潜在影响，我们以鳞翅目模式昆虫家蚕作为研究对象，分析了家蚕应答转chit42基因木霉菌胁迫中肠蛋白组学变化。通过PDQuest软件分析，共找到29个蛋白表现稳定的差异表达变化，并结合MALDI-TOF-TOF MS方法对蛋白进行了鉴定。结果表明，这些差异表达蛋白大多与能量代谢、蛋白合成、生长发育调控、信号转导及抗逆胁迫相关。与对照相比，谷胱甘肽-S-转移酶sigma2（GSTs2）为上调表达，已有研究表明，该蛋白的主要功能是催化谷胱甘肽的巯基与有毒亲电子类物质发生轭合反应，以达到解毒的目的，进一步的工作我们将围绕验证谷胱甘肽-S-转移酶sigma2的功能展开。本研究将有助于从组学角度认知转基因木霉工程菌对鳞翅目昆虫的影响，为评价转基因木霉菌生物安全性提供新方法，同时对筛选鳞翅目害虫作用靶标也具有重要价值。 5、谷胱甘肽-S-转移酶sigma2（GSTs2）基因功能分析 根据质谱鉴定结果，在NCBI网站上搜索GSTs2基因的cDNA序列，构建GSTs2基因RNA干扰（RNAi）载体，转化大肠杆菌HT115（DE3）感受态诱导GSTs2基因的dsRNA，将纯化后的dsRNA注射家蚕体腔，QRT-PCR检测干扰后家蚕GSTs2基因在RNA水平上的表达水平。结果显示，注射基因dsRNA后1d及3d均导致了GSTs2基因表达量下降的情况，而注射GFP基因dsRNA处理和注射ddH2O处理均未导致GSTs2基因表达量下降，说明GSTs2基因的表达在转录水平上受到了干扰。喂食含木霉菌工程菌处理的桑叶后，测定了GSTs2基因干扰后1d及3d家蚕的体重，结果显示，与未注射家蚕、注射ddH2O处理及注射GFP基因dsRNA处理相比，注射GSTs2基因dsRNA处理后家蚕生长受到显著影响。虽然注射ddH2O处理及注射GFP基因dsRNA处理也对家蚕生长受到影响，但是与注射GSTs2基因dsRNA处理相比，家蚕生长抑制更加明显，该结果表明，GSTs2基因确实与家蚕应答木霉菌胁迫相关。分析了GSTs2基因干扰对GST其他家族基因表达的影响，其中GSTo2基因表达量显著增加，推测该基因也与家蚕应答木霉菌胁迫相关。 综上所述，本研究明确了转绿僵菌chit42基因木霉菌工程菌杀虫活性的提高主要是由于绿僵菌源chit42的导入，而几丁质结合域与几丁质酶基因的融合对于转基因木霉菌杀虫抑病活性具有明显的促进作用。除了几丁质酶对中肠细胞的直接破坏作用外，中肠微生态失衡也是引起玉米螟死亡率上升的因素之一；利用鳞翅目模式昆虫家蚕为研究对象，在蛋白组学水平上分析了家蚕应答转基因木霉菌胁迫的中肠蛋白组学变化，对差异表达蛋白编码基因进行了功能验证，为转基因木霉菌的生物安全性评价提供了重要线索。