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印楝素A(Azadirachtin A)具有良好的杀卵活性,本文利用粉纹夜蛾卵细胞系(Hi-5细胞系)在细胞水平研究了印楝素A杀卵活性的毒性机理,其中较为系统地研究了印楝素A对细胞的防御体系的影响,以及对Hi-5细胞细胞增殖的影响。
1.用倒置显微镜观察观察到印楝素A处理Hi-5细胞后几天中,细胞形态发生了较大改变。用Giemsa染色,光学显微镜观察5μg/mL的印楝素A处理后的细胞形态的变化,1d后,细胞皱缩,贴壁效率降低,随后细胞变形加剧,伴有出泡现象,随时间延长现象愈发明显。研究了印楝素A对细胞还原型谷胱甘肽(GSH)的含量的影响。结果表明:细胞经印楝素A处理后,GSH的含量均下降,下降幅度变化趋于平缓,但维持与对照在一定的显著水平,随后GSH抑制率再次升高,5μg/mL的处理组较之1.25μg/mL影响更大。用电子透射显微镜观察印楝素A处理后的Hi-5细胞内亚显微结构的变化,发现1d后细胞内空泡数大量增加,随后有许多深色物质产生,高尔基体形态发生改变,胞吐现象明显增加。检测药剂处理后的Hi-5溶酶体功能抑制率,发现1.25μg/mL和5μg/mL印楝素A处理细胞后,细胞溶酶体功能抑制率随时间的延长逐渐上升,1.25μg/mL处理组低于5μg/mL的处理组。以异硫氰酸荧光素(FITC)荧光染料研究了Hi-5细胞的蛋白质含量变化,1.25μg/mL和5μg/mL印楝素A处理Hi-5细胞后,平均荧光强度均显著上升,且在第三天后发现有异常高强度的荧光峰出现,之后的峰数增加。用二乙酰荧光素研究印楝素A对细胞的非特异性酯酶的影响,发现在处理1的后,各处理浓度对细胞均能有效抑制酯酶活性,在随后3d抑制活性随时间的延长而减小,而后上升。研究印楝素A对Hi-5细胞膜电位的影响发现,1.25μg/mL和5μg/mL印楝素A处理细胞后,细胞膜电位下降明显,细胞膜通透性增加。
2.用MTT法研究了印楝素A对细胞的活性抑制,10μg/mL处理组在前两天的抑制率仅为13.725%和11.471%,但随后抑制活性上升,表明印楝素A能够有效抑制细胞增殖。研究了印楝素A对Hi-5细胞集落形成率的影响,1.25μg/mL处理组的细胞集落形成率仅为18.49%。20μg/mL处理组细胞0.5h、1h、2h和5h的集落形成率分别只有1.08%、0.57%、0%和0%,抑制效果十分明显。研究印楝素A对细胞周期的影响,5μg/mL印楝素A处理细胞后1d,Go/G1期升高至96.25%,第二天却降低至35.12%,而G2/M却上升至35.12%,随后G2/M期更是上升至82.88%,同时细胞凋亡率也显著上升。印楝素A处理细胞后,细胞蛋白周表达紊乱,在处理的第一天cyclin-B和cyclin-D均升高,之后回复至对照水平,但4d后再次升高。实验发现印楝素A处理细胞后1d,细胞核内染色体DNA即发生异常凝聚,随后核膜破裂,细胞核解体。
3.研究了印楝素A还能够很好的影响应力纤维的形态,影响细胞骨架正常的生理功能。通过实验数据,本论文认为印楝素A能够有效影响细胞对于外源药物的防御体系正常运转,抑制细胞增殖,为印楝素的杀卵活性及其毒性机理提供较好的参考。