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目的：
胰岛细胞分离、纯化的结果是胰岛移植成功的关键因素。胰岛的数量和质量的缺失取决于一些复合因素,包括胰岛分离过程中的应激和肝中移植部位的微环境等。胰岛移植到肝脏后,非特异性炎症物质级联反应将被启动,包括血凝途径激活和巨噬细胞和内皮细胞释放促炎症反应细胞因子(PIC)。我们假定完全阻断IL-1β和其细胞受体的结合能够在PIC引发分离的胰岛凋亡和坏死方面为胰岛提供更完全的保护。我们研究大鼠胰岛培养模型加PIC,以阐明胰岛损伤机制且测定阻断IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)能否为损伤提供保护。
材料与方法
一、材料
实验动物、主要设备、药品和试剂
普通级封闭群wistar大鼠,雌雄,体重250-280g。鼠显微手术器械,超净手术台,0.22um除菌滤器,电热恒温水浴箱(DHW-600),多功能振荡器,电子天平,微量加样器,荧光倒置显微镜(Olympus),高速离心机(TDL-5A),CO2细胞培养箱(Thermo)；全自动化化学发光免疫分析仪(美国雅培AXSYM)。胶原酶V型,Hank’s液,Ficoll-400,双硫腙(,DTZ),丫啶橙(AO),溴乙啶(EB)；RPMI-1640培养液,TNF-),IL-1ra,IL-1β； NO和一氧化氮合酶(iNOS)检测试剂盒。IFN-γ。
二、方法
(一)大鼠胰岛的分离和纯化。
1、采用明尼苏达大学改良法分离、纯化大鼠胰岛。胶原酶V原位灌注胰腺,快速切取,水浴消化。再经80目不锈钢筛网过滤、离心。然后采用Ficoll不连续密度梯度离心纯化胰岛。
(二)胰岛培养及分组
新鲜分离纯化的胰岛RPMI-1640完全培养基中培养24h。培养条件为:37℃,5％二氧化碳,95％空气。根据实验条件随机分为四组:A组(空白对照组)；B组(细胞因子组)；C组(IL-1ra组)；D组:(IL-1ra+细胞因子组).
三、观察指标
体外葡萄糖刺激下胰岛素释放试验。丫啶橙/嗅乙啶(AO/EB)荧光染色法显示胰岛细胞活率。检测胰岛培养液中NO胰岛组织中iNOS水平。
四、统计学分析
数据以(x)±s表示,使用方差分析和t检验,SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,P<0.05为有统计学差异。
结果
一、胰岛功能检测
胰岛素释放实验的结果显示,A组的胰岛经过24h培养后,胰岛素分泌水平较高,胰岛功能良好。B组胰岛功能严重受损,胰岛素分泌量和胰岛素释放指数(SI)均明显下降(P<0.01):D组胰岛素分泌量和SI均较B组明显升高(P<0.01)。C组胰岛在培养液中单纯加入IL-1ra后,胰岛素分泌及SI有所升高,但是没有统计学意义(P>0.05)；
二、胰岛活性鉴定
A组和C组胰岛经AO/EB染色后,倒置显微镜下可见大多数胰岛发出绿色荧光,提示胰岛存活良好。而B组的胰岛染色见大多数胰岛发出黄色荧光,提示胰岛存活不良,大量死亡。D组胰岛大多数仍保持完整外形,发出绿色荧光,存活情况明显好于B组。
三、胰岛培养液中NO水平和胰岛组织中iNOS活性
A组胰岛培养24h后,培养液中NO浓度及胰岛组织iNOS活性均比较低。
B组胰培养液中NO浓度和胰岛组织iNOS活性都较A组明显升高(P<0.01),尤其是iNOS活性超过A组10倍以上； D组胰岛组织的iNOS活性较B组受到显著抑制,NO水平也大大降低(P<0.01),与A组基本在同一水平,差别没有统计学意义(P>0.05)； C组胰岛iNOS活性及培养液NO浓度虽低于A组和D组,但差异没有统计学意义(P>0.05)。
结论
一.在IL-1β、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的刺激下,胰岛组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)可大量表达,催化合成的高浓度NO是β细胞损伤的效应因子。
二.IL-1ra对胰岛保护作用的机制可能在于,阻止IL-1β等pic与相关的细胞受体结合进而发挥生物生物效应,阻断细胞因子IL-1β和INF-α对胰岛的损害作用,阻断其对胰岛的毒性作用,从而减轻细胞因子对胰岛的损害,改善胰岛的存活与功能。