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目的前期体外实验已经证实，复方芪参提取物（Compound Astragalus and Salviamiltiorrhiza extract，CASE）能够显著抑制HepG2细胞的增值和侵袭。然而CASE抗肝细胞癌的作用仍不是很明确。因此，首先建立二乙基亚硝胺（diethylinitrosamine，DEN）诱导大鼠肝纤维化-肝癌动态模型来观察发生肝纤维化和肝癌的过程，随后观察CASE在肝纤维化-肝癌发生过程中的药理作用及其抗癌作用机制。方法1. DEN诱导大鼠肝纤维化-肝癌模型的建立雄性SD大鼠50只，将其随机分为DEN组和正常对照组，DEN组给予0.2%DEN溶液灌胃，每周5次至14周。对照组给予溶媒。分别于4、8、12、16周结束时处死动物。进行肝组织苏木精-伊红（HE）染色和Van Gieson（V.G）胶原纤维染色；分别采用免疫组化法和Western blot法检测肝组织中pSmad3L及PAI-1蛋白的表达。2. CASE通过抑制肝纤维化和PAI-1mRNA的表达而阻碍肝细胞癌发展2.1动物模型的复制和CASE的处理雄性SD大鼠180只，将其随机分为DEN组，正常对照组，CASE三个剂量组（60，120，240mg/kg），以及阳性药护肝片组。DEN组和CASE组和护肝片组均给予0.2%DEN溶液灌胃至14周，对照组给予溶媒。CASE三个浓度组同时灌胃（ig）给予不同浓度的CASE溶剂，护肝片组ig给予护肝片溶剂，每日1次。正常组与模型组ig给予等容量5g/L羟甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，直至16周。2.3血清学和羟脯氨酸含量检测收集12周，16周大鼠血液样本，分离血清检测血清学水平，采用莱氏法，全自动生化分析仪检测。血清透明质酸（hyaluronic acid，HA）采用放射免疫分析法进行检测。采用试剂盒检测羟脯氨酸含量，具体操作遵试剂盒说明书。2.4免疫组化SP法检测α-SMA和GST-P蛋白表达采用柠檬酸钠缓冲液热抗原修复，S-P法免疫组织化学染色，用DAB/H2O2显色，苏木精复染检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、胎盘型谷胱甘肽硫转移酶（Glutathione S-transferase placenta，GST-P）蛋白的表达。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。2.5细胞培养与处理HepG2细胞贴壁长至单层90%-95%时用胰酶消化，以含10%FBS的DMEM调整细胞密度1×106/L接种于培养皿内，5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养。实验分为溶媒对照组，TGF-β1组，CASE三个浓度组（20，40，80μg/ml）。2.6荧光实时定量RT-PCR法检测CASE对TGF-β1诱导的PAI-1mRNA水平的影响培养结束后提取各组细胞总RNA，逆转录为cDNA，利用各自引物进行靶基因PAI-1和管家基因β-actin的PCR反应，计算PAI-1mRNA的相对表达量，以β-actin为内参；根据融解曲线确定扩增反应的特异性。结果1DEN能够成功诱导大鼠肝纤维化-肝癌模型实验结果显示对照组肝组织结构正常，12周时，增生的胶原束包绕并分割肝小叶，正常的肝小叶结构被破坏，假小叶形成；到16周结束时，剩余存活大鼠均形成肝癌，肝癌细胞排列成条索状或团块状，异型性明显。结果显示，Smad3连接区磷酸化（pSmad3L）和纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor，PAI-1）在正常肝组织中几乎无表达，DEN组4周-12周表达量逐渐增加，到16周时达到高峰。2CASE能通过抑制肝纤维化和PAI-1mRNA的表达而阻碍肝细胞癌发展2.1CASE能够降低DEN诱导的大鼠肝癌的发生率和多样性16周时，DEN诱导的大鼠肝细胞癌的发生率为100%，多样性为3.622.13。CASE呈浓度依耐性降低肝脏肿瘤发生率和多样性。2.2CASE能够调节DEN诱导的大鼠血清学水平以及降低羟脯氨酸含量造模第12周CASE能明显降低DEN升高的丙氨酸转氨酶，碱性磷酸酶，γ-谷氨酰转肽酶，谷草转氨酶，透明质酸和羟脯氨酸的含量。造模第16周，CASE三个剂量组均能显著降低DEN升高的直接胆红素，总胆红素，碱性磷酸酶，透明质酸的水平，升高DEN降低的白蛋白和总蛋白水平。2.3CASE能够降低α-SMA蛋白在DEN性纤维化-肝癌大鼠肝脏组织和细胞中的分布造模第12周CASE各剂量组均能显著地抑制纤维化肝组织α-SMA的表达。造模第16周，CASE呈浓度依耐性降低DEN诱导的α-SMA表达，在120和240mg/kg浓度上达到统计学显著差异。2.4CASE能够降低GST-P蛋白在DEN性纤维化-肝癌大鼠肝脏组织和细胞中的分布造模第12周，CASE呈浓度依耐性降低GST-P的表达。造模第16周，DEN模型组GST-P的表达量增加，但是与12周模型组GST-P表达量比较相对较低。CASE呈浓度依耐性降低GST-P的表达。2.5CASE降低TGF-β1诱导的PAI-1mRNA水平实时定量RT-PCR结果显示，CASE呈浓度依耐性降低TGF-β1诱导的PAI-1mRNA表达水平。结论1. DEN诱导大鼠12周时发生纤维化，16周时发生肝癌，在肝纤维化-肝癌发生发展过程中，pSmad3L和PAI-1蛋白的表达逐渐增强。2. CASE能显著降低DEN诱导大鼠肝癌的发生率和多样性。3. CASE能显著改善肝功能相关的血清学指标，表明该药对肝细胞具有保护作用。4. CASE能显著降低α-SMA表达以及透明质酸和羟脯氨酸的含量，表明可能是通过抑制DEN诱导的大鼠肝纤维化程度而阻止肿瘤的形成。5. CASE可能通过降低癌前病变指标GGT和GST-P的表达来阻止DEN诱导的肝癌的发生。6. CASE能够呈浓度依赖性降低HepG2细胞内TGF-β1升高的PAI-1的转录水平，提示，CASE抗肝纤维化从而阻滞肝癌的发展与TGF-β1/Smad信号通路有关。