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氨酰tRNA合成酶是一类能催化tRNA与特定氨基酸前体发生酯化反应的酶,氨酰tRNA合成酶不但是蛋白质合成过程中的一类重要的酶,还参与了转录、翻译水平的调控、RNA剪接、信号传导以及免疫等生命活动。自然界中存在2种结构完全不同的赖氨酰tRNA合成酶LysRS-Ⅰ、LysRS-Ⅱ,负责赖氨酸密码子的翻译,而蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC14579)中存在赖氨酰-tRNA合成酶Ⅰ(1ysRSⅠ)和lysRSⅡ两种基因,lysRSⅠ是非必须基因,而lysRSⅢ是必须基因,lyysRSⅠ前期不表达,后期表达,因此lysRSⅠ基因受到启动子的严格调控。因此研究lysRSⅠ启动子对研究B.c中lysRSⅠ基因的生物学功能有非常重要的意义。
1,构建了不同长度lysRSⅠ基因启动子,分别敲除掉启动子5端300bp、393bp和662bp长度的片段,通过基因工程的方法将GFP基因片段连接到启动子3端之后,构建了不同长度启动子的基因工程菌,并研究了所构建的基因工程菌的荧光表达情况,通过实验,我们发现当敲除掉393bp片段后,GFP并没有表达,而敲除掉300bp和662bp基因片段后,GFP的表达情况并没有受到影响,并且当敲除掉662bp的片段后,荧光强度更加强。
2,我们进一步研究了lysRSⅠ基因的转录起始位点,通过反转录加G尾,然后测序的方法,我们寻找到了lysRSⅠ基因的转录起始位点,其位于5端371bp的位置,这个转录起始位点与我们上述得到的现象一致,解释了上述观察到的现象,但并没能解释敲除662bp后的荧光现象,因此,我们进一步研究了B.c14579-pUBC-P662-GFP的转录起始位点,通过同样的方法,我们确定敲除662bp后,其转录起始位点位于pUBC19质粒上。
3,我们在pUBC19质粒紧靠启动子的5端插入t1t2转录终止子,通过基因工程的办法将不同长度lysRSⅠ基因启动子连到终止子之后,观察插入终止子后对GFP表达的影响,通过实验,我们可以看出,插入终止子后对B.c14579-pUBC—P300-GFP和B.c14579-pUBC-pLys-GFP的荧光强度没有影响,但对B.c14579-pUBC-P662-GFP的荧光影响较明显,这更进一步验证了敲除662bp后的转录起始位点位于pUBC9质粒上。
4,我们对lysRSⅠ启动子进行了6个突变,并且观察了不同突变后的荧光效果,突变主要围绕lysRSⅠ基因启动子上的茎环结构,通过突变我们研究了茎环结构对lysRSⅠ基因表达的影响,T1突变与B.c ptt-pG在LB中没区别,但在无机盐培养基中差别较大,T2和T3经突变后没有荧光,T4突变后在LB中有荧光,但荧光较弱,T5和T6突变,两者突变后效果一致,都部分含有荧光。