论文部分内容阅读
目的苏尼替尼(Sunitinib)在临床治疗晚期肾癌(ARCC)和胃肠道间质瘤(GIST)均有较佳的治疗效果,是首个上市的多靶点受体酪氨酸激酶制剂。然而脱靶效应造成的心脏毒性是该药临床应用的主要限制因素之一,阻碍了Sunitinib在临床中的广泛应用。探讨研究Sunitinib心脏毒性的分子机制,寻找可行的保护性靶标蛋白对于Sunitinib的临床应用有着十分重大的启示作用。我们前期研究发现Sunitinib作用心肌细胞能诱导心肌细胞发生自噬,最终导致心肌损伤。为深入研究这一问题,本课题旨在研究Sunitinib诱导心肌细胞自噬的作用机制,回溯寻找介导自噬发生的关键靶标,针对靶标寻找能够保护Sunitinib诱导心脏毒性的抑制剂或激动剂,为了Sunitinib心脏毒性保护提供数据支持,从而达到挖掘Sunitinib临床应用深度的最终目的。方法采用裸小鼠移植瘤模型、Sprague-Dawley大鼠模型、大鼠新生鼠原代心肌细胞,确认Sunitinib在临床治疗剂量下产生明显的心脏毒性,该心脏毒性伴随有致死性的自噬发生。(1)采用SD大鼠模型,灌胃给予临床治疗转移性肾癌剂量的Sunitinib 30天,通过检测血清中心肌酶谱相关生化指标肌激酶同工酶(CK-MB)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)研究Sunitinib所诱发的心脏毒性。(2)检测Sunitinib给药后大鼠心电图和超声心动图的变化,确证Sunitinib作用下大鼠发生与临床一致的心脏毒性变化。(3)采用786-0裸小鼠移植瘤模型,灌胃给予临床治疗肾癌剂量的Sunitinib,31天后从瘤重、肿瘤体积(TV)、相对肿瘤体积(RTV)等方面评估Sunitinib抗肿瘤能力。(4)对试验结束时裸小鼠行心脏脏器指数分析,并在用心肌组织切片HE染色,探索Sunitinib在发挥抗肿瘤药效时心脏毒性的发生情况。(5)透射电镜(TEM)检测大鼠心肌组织受Sunitinib影响下自噬的发生情况,以Western Blot法检测自噬相关蛋白LC3的表达情况。(6)运用TEM再次确证原代心肌细胞中自噬的发生情况与发生强度。采用ICR小鼠模型、SD大鼠模型和大鼠原代心肌细胞模型,体内外检测甘草酸GA对Sunitinib心脏毒性的保护作用。(1)采用原代心肌细胞模型,以MTT法检测GA保护下Sunitinib作用心肌细胞存活率的变化情况。(2)采用SD大鼠模型,灌胃给予临床剂量的Sunitinib和GA 30天,尾静脉取血,对大鼠CKMB、AST、LDH的血清指标进行检测,评价GA对Sunitinib心脏毒性的保护作用。(4)麻醉大鼠后进行心电图和超声心动图检测,检测在GA保护下Sunitinib诱导的心脏输血功能减弱的变化情况。(5)取心脏组织作石蜡切片HE染色,观察GA对Sunitinib心脏病理性变化的保护能力。采用SD大鼠模型、大鼠新生鼠原代心肌细胞,体内外探索HMGB1介导的自噬在甘草酸干预Sunitinib心脏毒性的作用和分子机制。(1)采用原代心肌细胞和SD大鼠模型,以Western Blot法和TEM检测甘草酸对Sunitinib触发心肌自噬的影响。(2)采用原代心肌细胞和SD大鼠模型,以RT-PCR, Western Blot法和荧光共聚焦显微技术检测Sunitinib对心肌组织和心肌细胞中HMGB1表达和亚细胞分布的影响。(3)采用大鼠新生鼠原代心肌细胞,运用丙酮酸乙酯(EP)抑制HMGB1的核转位能力,以免疫荧光检测HMGB1的亚细胞分布,Western Blot法检测HMGB1的亚细胞分布对sunitnib触发自噬的影响,MTT法检测心肌细胞存活率变化情况。(4)运用小分子RNA干扰技术,沉默心肌细胞中的HMGB1蛋白表达,Western Blot法和TEM检测HMGB1的表达对sunitnib触发自噬的影响,MTT法检测心肌细胞存活率变化情况。(5)采用原代心肌细胞和SD大鼠模型,以RT-PCR, Western Blot法和荧光共聚焦显微技术检测甘草酸对Sunitinib上调的心肌组织和心肌细胞中HMGB1表达和亚细胞分的影响。(6)采用Western Blot和免疫沉淀检测方法,检测Sunitinib作用下Beclinl蛋白表达水平变化,验证HMGB1与Beclinl的结合情况。(7)采用Western Blot和免疫沉淀检测方法,检测Sunitinib作用下Bcl2的磷酸化水平变化与HMGB1表达的水平之间的关系,和Bcl2与Beclinl的结合情况。(8)采用Western Blot和免疫沉淀检测方法,检测甘草酸对sunitinib引起的HMGB1与Beclinl结合增加、Bcl2与Beclinl结合减少的影响。结果1) Sunitinib在临床治疗肾癌剂量下诱导明显的心脏毒性,并伴随有自噬的发生。Sunitinib 100mg/kg灌胃给药30天后,引起明显心脏功能性变化,与对照组相比Sunitinib给药组大鼠血清心肌酶谱CKMB、AST、LDH含量明显增高,大鼠心电图显示R波振幅显著降低,超声心动图发现Sunitinib组大鼠室射血分数与左室短轴缩短率出现功能性衰变现象,证实Sunitinib作用下心脏出现左室功能性影响,发生明显心脏毒性。临床换算100mg/kg的Sunitinib灌胃给药31天,786-0移植瘤裸小鼠发挥抗肿瘤作用的同时出现明显体重降低现象,实验结束时Sunitinib心脏脏器指数远小于正常组。心肌组织HE染色切片显示Sunitinib组可见心肌细胞水肿,横纹不清,排列紊乱,心肌病变表征明显。对大鼠心脏组织的冰冻切片作透射电镜,显示Sunitinib组中出现双层膜结构的自噬体,对该组织Western Blot检测LC3表型,出现明显Ⅱ型高表达,指征自噬的发生。同时以梯度浓度Sunitinib作用原代心肌细胞,TEM显示自噬体的形成,并伴随有最终核膜破裂,细胞坏死的发生,说明Sunitinib作用下心肌细胞自噬并最终导致细胞坏死。2)GA干预Sunitinib心脏毒性的作用。体外试验以MTT法证明GA 50 μM能明显回调Sunitinib 5 μM所引起的心肌细胞死亡。Sunitinib 100mg/kg和GA 10mg/kg灌胃30天后,尾静脉取血,心肌酶谱结果表明GA能明显保护Sunitinib诱发的CKMB, AST, LDH血清高浓度现象。心肌组织HE切片染色观察可知GA能明显减少Sunitinib诱导的心肌细胞水肿,横纹不清,排列紊乱等病理性心肌表现。心电图显示GA能有效保护Sunitinib作用下心肌组织出现的R波波幅下降现象。同时对超声心动图检测结果分析可知GA作用下, Sunitinib诱发的左室射血分数下降和左室短轴缩短率下降均可得到明显的缓解。3)甘草酸通过抑制苏尼替尼引起的HMGB1增高,降低HMGB1与Beclin1的结合,通过抑制Bcl2蛋白磷酸化增加Bcl2与Beclin1结合,干预苏尼替尼触发的心肌组织和心肌细胞自噬,发挥拮抗sunitinib心脏毒性的作用。Western blot法和TEM发现GA作用下原代心肌细胞的自噬和坏死得到下调,大鼠心肌组织中自噬泡的形成也得以减少。证明GA抑制Sunitinib诱导的自噬,从而保护心脏避免Sunitinib引发的毒性。RT-PCR, Western Blot法和荧光共聚焦显微技术显示Sunitinib作用下,心肌组织和心肌细胞中HMGB1转录水平和蛋白水平发生上调,并由细胞核向细胞浆转位。通过EP抑制HMGB1的核转位,发现sunitnib触发自噬受到抑制,心脏损伤得到缓解。运用小分子RNA干扰技术,沉默心肌细胞中的HMGB1蛋白表达,显示sunitnib触发自噬受到抑制,心脏损伤得到缓解。甘草酸作用下可在转录水平下调sunitnib引起的HMGB1表达增高。细胞浆的HMGB1通过a)与Beclin1结合激活自噬；b)激活Bcl2的磷酸化,抑制Bcl2与Beclin1的结合,从而激活自噬。甘草酸通过抑制HMGB1的转录水平,a)阻断其与Beclin1的结合；b)下调Bcl2的磷酸化,增加Bcl2与Beclin1结合,从而干预sunitnib引起的心肌自噬。结论：本论文在体内模型证明Sunitinib发挥抗肿瘤作用剂量下能诱导明显心脏损伤。天然来源的化合物甘草酸可干预sunitinib的心脏毒性。其作用机制是通过在转录水平抑制sunitnib上调的HMGB1,阻断了其蛋白表达增加和核转位,进而干预HMGB1与Beclinl的结合,阻断Bcl2的磷酸化,增加其与Beclinl的结合,最终抑制sunitinib触发的心肌自噬,为Sunitinib临床应用拓展了开发深度和理论依据。