【摘 要】
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Caspase 8是半胱氨酸蛋白酶家族的成员之一，又名FLICE(FADD like ICE)，大小为55kDa，近年的研究表明，caspase 8不仅参与细胞凋亡，还在细胞增殖分化以及小鼠胚胎发育中起着重要作用
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Caspase 8是半胱氨酸蛋白酶家族的成员之一，又名FLICE(FADD like ICE)，大小为55kDa，近年的研究表明，caspase 8不仅参与细胞凋亡，还在细胞增殖分化以及小鼠胚胎发育中起着重要作用。为了更好地研究caspase 8在生物体内的作用途径，我们利用酵母双杂交系统，以caspase 8为诱饵蛋白从小鼠T淋巴瘤和7.5天胚胎cDNA文库中筛选与之存在相互作用的蛋白质，以期研究其在生物体内的作用途径。经过多步筛选、验证和分组之后，我们最后得到了18个阳性克隆。为了进一步确定其相互作用的可靠性，我们将得到的这些阳性克隆基因转构到哺乳动物表达载体pCI-HA或者pRK5—FLAG中，然后利用免疫共沉淀技术在哺乳动物细胞293T细胞中验证它们与caspase 8是否存在相互作用，经过反复实验发现，ACT9和ACT18克隆为IP阳性结果。从BLAST结果得知，ACT9克隆与空泡分选蛋白41(VPS41)具有较高同源性，VPS41主要参与高尔基体相关的空泡蛋白的形成以及分选过程，其中包括了多种重要的水解酶类，提示caspase 8可能通过与之相互作用而影响蛋白分选乃至蛋白水解；而ACT18克隆与肿瘤敏感性基因101(TSG101)具有较高同源性，TSG101跟细胞的转录调控、泛素介导的蛋白降解、维持正常的细胞周期和基因组的稳定以及帮助病毒蛋白的包装和出芽等多种生物学功能相关，提示caspase 8可能通过与之相互作用而影响蛋白降解以及细胞凋亡等过程。微囊藻毒素是由淡水微囊藻产生的次生代谢物，结构为环状七肽，分子量约为1000Da，对生物机体具有多种毒理作用，是一类较强的肿瘤促进剂，目前没有比较简单便宜的藻毒素的检测方法，于是我们拟建立一个利用酵母双杂交系统进行藻毒素检测的系统。前期实验已用噬菌体表面展示肽库技术从随机12和7肽库中筛选获得若干与藻毒素有相互作用的多肽，分别挑选其中亲和力较高的3个多肽，将它们的基因构建到酵母双杂交系统，使不同的肽段分别融合在含有AD和BD的酵母表达载体中，共转化酵母菌株AH109，通过测定β-半乳糖苷酶活性来反映下游报告基因半乳糖苷酶的表达情况，从而反映培养基里面是否含有藻毒素。结果表明，利用此方法可以比较方便地检测藻毒素。
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