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目的:制备肺炎克雷伯杆菌特异性卵黄抗体(IgY),考察其体外抑菌活性及对小鼠克雷伯杆菌肺炎的保护作用。
方法:以灭活的肺炎克雷伯杆菌为抗原免疫蛋鸡获得特异性IgY。通过水稀释、硫酸铵盐析、硫酸钠盐析和超滤等方法分离纯化抗体,再经冷冻干燥制成冻干粉。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗体的纯度;采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定卵黄水溶性组分中的抗体效价。采用液体培养基比浊法考察不同浓度的特异性IgY对抗原菌的生长抑制活性。经鼻滴入肺炎克雷伯杆菌(2×1011cfu/ml)建立小鼠肺炎模型,攻毒剂量为每只100μl。小鼠随机分为空白对照组(不感染肺炎克雷伯杆菌)、阴性对照组(生理盐水)、头孢哌酮组(1 mg/ml)、地塞米松组(0.5mg/ml)、特异性IgY高剂量组(40mg/ml)、特异性IgY低剂量组(20mg/ml)。攻毒前24h给药一次,除地塞米松组为每50μl/10g外,其余各组小鼠为150μl/10g;攻毒后每隔24 h给药一次,连续四天,除地塞米松组为100μl/10g外,其余各组小鼠为250μl/10g。观察小鼠的临床表现、体重、体温、白细胞计数、各组小鼠的死亡率、肺组织细菌培养、肺组织外观及肺病理切片。
结果:经水稀释、盐析和超滤得到IgY的纯度与标准IgY相近。ELISA检测表明首次免疫后40～45天效价达到1600。体外抑菌试验表明,特异性IgY浓度在1～20 mg/ml之间能抑制肺炎克雷伯杆菌的生长且呈剂量依赖性,但其活性低于阳性对照头孢哌酮。肺炎克雷伯杆菌攻毒后,除空白对照组外,各组小鼠体温、体重、外周血中WBC数均有不同程度下降,IgY治疗组的下降明显低于阴性对照组,与阳性对照头孢哌酮组和地塞米松相近;除空白对照组外,其余各组小鼠肺组织细菌培养均呈阳性;IgY治疗组和阳性对照组细菌计数低于阴性对照组;肺组织有不同程度的损伤,肺病理切片显示肺泡结构破坏、肺纤维化,IgY治疗组和阳性组损伤程度低于阴性组;各组小鼠四天的死亡率分别为:空白对照组为O,阴性对照组为90％,其余均为80%。
结论:实验中采用的分离纯化方法可获得高纯度的IgY。所制备的特异性IgY具有高效价和明显的体外抑菌活性。特异性IgY对小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎有保护作用。