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卵巢痛是引起妇女死亡的第五大肿瘤,其死亡率占妇科肿瘤死亡的第一位。耐药和复发是影响患者预后的最主要因素。在研究肿瘤发生发展的过程中,学术界提出了肿瘤干细胞学说——一肿瘤组织中存在一小部分具有干细胞特征的特殊细胞亚群,具有自我更新、增殖分化和在体内远隔部位形成新肿瘤病灶的能力,同时对化疗和放疗不敏感。如果能靶向性或选择性杀伤肿瘤干细胞便可能根治肿瘤,防止肿瘤复发和转移[2]。目前该学说已在血液系统肿瘤和部分实体瘤组织或细胞株中获得初步证明,然而有关研究仍处于起步阶段,缺乏高效可靠的分离方法和研究平台,限制了肿瘤干细胞生物学研究的开展。
目的:在前期工作的基础上我们将进一步研究新的、更可靠的卵巢癌肿瘤干细胞的表面标记物,尝试改进分离肿瘤干细胞的方法,并探讨利用卵巢癌细胞株作为卵巢癌肿瘤干细胞研究平台的可行性,为进一步开展肿瘤干细胞生物学特征研究提供基础。
1.人卵巢癌细胞株侧群细胞的分离和鉴定
方法:利用流式细胞术从人卵巢浆液腺癌细胞株OVCAR3中分离排斥双苯酰亚胺染色的侧群细胞以及能被其染色的非侧群细胞,比较两个亚群的细胞集落形成率,并检验其在软琼脂平板生长和形成细胞球的能力。
结果:OVCAR3细胞株中排双苯酰亚胺染色的细胞占2.0％,此活动对维拉帕米敏感。侧群细胞和非侧群细胞克隆形成率分别为46.17±23.272％和6.17±3.055％(p<0.05,差异有显著性),侧群细胞克隆形成率高于非侧群细胞,并能在软琼脂平板中生长、形成细胞球。非侧群不能形成细胞球。
结论:人卵巢浆液腺癌细胞株OVCAR3中存在排斥Hoechst 33342染色、对维拉帕米敏感的SP细胞；此类细胞具有肿瘤干细胞的生物学特征。
2.OVCAR3细胞中乳腺癌耐药蛋白与侧群表型关系的探讨
方法:利用免疫荧光染色和免疫印迹检测侧群细胞和非侧群细胞中乳腺癌耐药蛋白的表达情况及其规律,比较两者的差异。
结果:免疫荧光染色显示,经双苯酰亚胺处理的OVCAR3细胞中染料深染、乳腺癌耐药蛋白阴性细胞与染料淡染、乳腺癌耐药蛋白阳性细胞共区域化分布,免疫印迹检测结果显示侧群细胞表达乳腺癌耐药蛋白,非侧群细胞无表达。
结论:乳腺癌耐药蛋白与侧群细胞关系密切,前者是后者表型的主要决定因素,提示乳腺癌耐药蛋白可作为肿瘤于细胞的表面标记物。
3.乳腺癌耐药蛋白阳性细胞生物学特性的研究
方法:利用乳腺癌耐药蛋白单克隆抗体,通过荧光激活细胞分类术从人卵巢浆液性腺癌细胞株OVCAR3中分离得蛋白表达阳性及阴性的细胞亚群,观察并比较两者的生长特性,检验不同表型的细胞在裸鼠体内形成肿瘤的能力。
结果:表达乳腺癌耐药蛋白的阳性细胞在体外培养中可形成细胞克隆,分化产生不表达该蛋白的子代细胞,在裸鼠体内可形成新的肿瘤,其组织学特征与原肿瘤相似。不表达乳腺癌耐药蛋白的阴性细胞在体外培养条件不能形成细胞集落,并在培养过程中逐渐死亡,在裸鼠体内不能形成肿瘤。
结论:表达乳腺癌耐药蛋白阳性细胞,其生物学特性符合肿瘤干细胞的定义,乳腺癌耐药蛋白是人卵巢癌肿瘤干细胞标记物。使用荧光标记的ABCG2单克隆抗体进行卵巢癌干细胞的分选,可以取代侧群细胞分析法应用于远期研究工作。卵巢浆液性腺癌细胞株OVCAR3中存在符合肿瘤干细胞特征的细胞亚群,是一个比较理想的肿瘤干细胞研究平台。