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α-淀粉酶从微生物到高等动植物均有分布,是淀粉酶家族中的内切型淀粉酶。α-淀粉酶能随机水解淀粉α-1,4糖苷键,分子量约为50,000道尔顿。作为产量最大的酶类之一,α-淀粉酶已广泛应用于淀粉加工业、面包工业、发酵工业、饲料制造等,用途极为广泛。有机相酶催化又称微水相酶催化或非水相催化,是从传统酶学的领域中发展起来的,是生物技术中具基础性和应用性的研究领域。有机相酶催化具有许多在水相中不可相比的优势。通过改变有机溶剂系统的性质能改变酶催化反应的速度和选择性,有机相酶催化在化学工业、新药品开发和特种新材料的研制上有着广泛的应用前景和潜力。当前国内外尚未有关于α-淀粉酶在有机溶剂中催化水解反应的性质研究的系统报道。
本实验在前人研究其他酶类的基础上,以水溶性有机溶剂二甲基亚砜、1,4-环氧六环、乙腈、丙酮、丁酮、四氢呋喃为效应物,可溶性淀粉为反应底物,研究水/有机溶剂单相共溶体系中有机溶剂对α-淀粉酶催化活性的影响。探讨不同种类有机溶剂、温度、反应体系pH值等参数对有机溶剂中α-淀粉酶活性的影响,以及酶在有机溶剂体系中的催化动力学,并通过测定α-淀粉酶在有机溶剂作用下的紫外吸收光谱、紫外差示光谱、荧光发射光谱等光谱分析,从而揭示酶活力及二级结构与有机溶剂本身结构及性质之间的关系。研究发现,丙酮在一定浓度范围内(≤1%),可以略微提高α-淀粉酶的活力,其中1%的丙酮可以使酶活力上升约1.4%,当浓度超过1%后,丙酮对酶活性产生抑制作用。其余的溶剂随溶剂浓度的增加对该酶均表现为不同程度抑制作用。其中二甲基亚砜对酶的抑制程度最深,50%的二甲基亚砜中的酶活力仅保留了17.1%。研究酶在上述溶剂中的温度一活力曲线和pH-活力曲线发现,缓冲液和有机溶剂中酶的最适温度均为40℃,最适pH值为5.8~6.2,变化曲线和具体值因有机溶剂种类不同而有一定差异。研究该酶在上述溶剂体系中的动力学,结果表明在六种溶剂中酶的K<,m>值和V<,max>值与在缓冲液中相比均发生了不同程度的变化。其中二甲基亚砜、乙腈和丙酮对酶活力抑制类型为线性混合型,1,4-环氧六环为类似非竞争性抑制作用,丁酮和四氢呋喃则为类似竞争性抑制作用。
通过光谱分析,可解释α-淀粉酶在上述有机溶剂中酶分子二级结构构象变化与活力之间的关系。对α-淀粉酶在缓冲液及上述六种有机溶剂中的紫外吸收光谱、紫外差示光谱和荧光发射光谱分析发现,α-淀粉酶在上述有机溶剂体系中酶的构型和构象都发生了不同程度的改变,主要表现在肽基团的变化和芳香族氨基酸的微环境的改变以及酶分子主链发生去折叠变化。其中二甲基亚砜对酶的作用主要是体现在对酶蛋白主链构型的改变,而其余的有机溶剂则是使酶的三级结构变得松散,体现在酶蛋白构象的变化上。荧光发射光谱分析发现酶在不同浓度的二甲基亚砜中,α-淀粉酶的荧光强度随着有机溶剂浓度增加而升高;在1,4-环氧六环和乙腈中荧光强度则随着浓度增加先降后升;在低浓度四氢呋喃中,荧光强度有所降低,随着浓度的增加,发射峰位置蓝移,荧光强度降低,但相对于低浓度时有所增加;低浓度丙酮和丁酮已使α-淀粉酶的荧光发生了淬灭。