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纤维素酶是一种重要的工业酶，在纤维素糖化、造纸、纺织、酿酒等工业过程中广泛应用。里氏木霉是科学研究及工业生产中应用最为广泛的纤维素酶产生菌，里氏木霉纤维素酶分泌过程是在诱导条件下进行的，其分泌过程起始于菌体对环境信号的感知，细胞内的信号转导，进而发生纤维素酶编码基因的转录，经过核糖体的翻译，初生纤维素酶蛋白在内质网及高尔基体进行折叠和修饰，最终通过膜泡运输分泌到细胞外。通过基因工程进行菌种的理性设计是提高纤维素酶产量的有效手段，然而大量实验表明仅通过纤维素酶或其基因的改造，只能有限地提高纤维素酶的生产能力，并不满足实际生产的需要。而深度解析里氏木霉纤维素酶的调控、合成以及分泌机制，功能鉴定关键调控因子，可以为菌株理性设计提供改造靶点。本论文主要研究了里氏木霉中纤维素酶合成分泌过程中蛋白翻译后过程的不同途径的响应机制，以及阐明了参与蛋白质折叠过程中二硫键形成及打开的两个硫氧还蛋白家族成员:TrPDI2及TrTRX1对于里氏木霉生长及纤维素酶产生的作用，并分析其作用机理，进而揭示了环境胁迫对里氏木霉纤维素酶产生的影响。具体研究内容如下: 1、以QM9414和Rut C30两个产酶能力不同的里氏木霉突变体为研究对象，在纤维素酶诱导条件下，对参与未折叠蛋白响应(UPR)、内质网降解途径及膜泡运输等各途径的潜在调控基因进行了转录水平分析。结果显示在以微晶纤维素为诱导物进行诱导的过程中，位于内质网的未折叠蛋白感受器、分子伴侣及折叠酶等的编码基因上调表达，而参与胞内膜泡转运环节的蛋白表达量无明显变化，因此推测以微晶纤维素为诱导物的诱导过程可以诱发UPR，而且相对QM9414菌株，Rut C30菌株中参与UPR的各种元件的表达更早且强度更高，同时胞内纤维素酶的存留量更少，而胞外蛋白质产量及纤维素酶活力更高。研究结果表明及时有力的未折叠蛋白响应，以及增强的胞内蛋白质转运可以提高里氏木霉纤维素酶的生产能力，因此提高里氏木霉蛋白折叠和修饰能力可能是一种可行的里氏木霉纤维素酶生产的改造策略。 2、通过同源比对分析了里氏木霉中的二硫键异构酶(PDI)蛋白TrPDI2，其与黑曲霉TIGA、里氏木霉TrPDI1的序列同源性为36.94和11.81％;进一步通过失活的RNase的酶活性复性分析证实其具备二硫键异构酶活性;Trpd2基因的过量表达显著提高了纤维素酶主要组分CBH1的分泌能力及活性。体外DTT处理CBH1蛋白及蛋白活性测定结果显示二硫键对于纤维素外切酶活性非常重要，因此推测Trpdi2通过提高二硫键形成能力促进纤维素外切酶的产生;另外免疫分析证实TrPDI2的表达水平及氧化还原状态都会响应纤维素酶的诱导，以提供持续的氧化力保证纤维素外切酶折叠。综上所述，TrPDI2作为存在于里氏木霉的二硫键异构酶，在纤维素酶诱导过程中，通过其表达水平提高以及氧化还原状态变换提高二硫键形成能力，因而促进蛋白质的折叠成熟，提高纤维素外切酶的分泌。 3、以线粒体硫氧还蛋白(TⅨ)的编码基因Trtrx1为研究对象，解析里氏木霉的线粒体Trx在抗氧化胁迫下的作用机制。首先通过亚细胞定位及活性检测，证实TrTRX1是一种线粒体定位的硫氧还蛋白。在△Trtrx1突变体中，Trtrx1基因的缺失并不改变里氏木霉的生长，也未明显影响里氏木霉对于活性氧的抗性;在正常生长条件下缺失Trtrx1同样没有影响里氏木霉总GSH含量，但是在氧化胁迫下总GSH含量显著增加;另外外源GSH的添加引起Trx相关基因的表达量显著下降。因此推测GSH系统是里氏木霉线粒体中维持氧化还原状态的主导因素，而里氏木霉的线粒体硫氧还蛋白TrTRX1，不是里氏木霉正常生长及氧化胁迫抗性所必需的，有可能辅助性参与里氏木霉对氧化胁迫的抗性。 本论文研究结果有助于深入理解里氏木霉纤维素酶合成分泌蛋白翻译后加工调控机制，加深对里氏木霉胁迫抗性系统的认识，为通过分泌过程及氧化胁迫抗性的改造提高产酶能力提供基础。