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腐蹄病（Footrot）是由坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）和节瘤拟杆菌（Baeteroidesnodosus）协同感染引起的以侵害反刍动物趾间皮肤及深层软组织为主的一种高度接触性传染病，该病的特征是：动物蹄部组织化脓、坏死、腐败以及角质层破坏。目前，在我国牛、羊饲养场中，腐蹄病的发生率可达到50％，是牛、羊，尤其是奶牛养殖业中危害性最大的传染病性疾病之一。患腐蹄病的奶牛，通常表现为食欲减退、泌乳量下降、繁殖能力降低等特征，严重者导致被迫淘汰，从而严重地影响到奶牛的生产性能和产奶质量，给奶牛业带来了巨大的经济损失，因此，我国牛、羊，尤其是奶牛腐蹄病的免疫预防工作显得十分重要。目前，国内外对该病的预防主要依赖于传统的灭活菌苗，其在腐蹄病的预防中发挥了积极作用，同时也暴露出它免疫效果差、严重的副反应及大量生产困难等缺点，因此，牛羊腐蹄病基因工程疫苗的研究是十分必要的。目前，国内外关于细菌的新型疫苗主要是基于细菌的毒素或是表面的菌毛蛋白的重组亚单位疫苗。与节瘤拟杆菌相比，坏死梭杆菌在引起患病奶牛蹄部损伤和机体的病理变化过程中发挥主要的作用。研究表明坏死梭杆菌的白细胞毒素是引起腐蹄病的一个主要毒力因子，动物实验证明：抗坏死梭杆菌白细胞毒素的多克隆抗体对坏死梭杆菌的再次感染具有良好的保护作用，所以，坏死梭杆菌白细胞毒素是研制预防牛羊腐蹄病重组亚单位疫苗的首选靶蛋白。本试验克隆坏死梭杆菌白细胞毒素全长基因后，利用原核表达系统（pGEX-6p-1载体和pPRO-EX-HTa载体）成功地表达了含有坏死梭杆菌白细胞毒素蛋白主要抗原表位区的5个片段（PL1、PL2、lktA3、PL4和PL5），Western blot结果显示，5个重组白细胞毒素蛋白均与坏死梭杆菌多克隆血清反应；动物试验结果表明：5个重组白细胞毒素蛋白免疫的鼠能够抵抗强毒株坏死梭杆菌A25的攻击，同时，这5个重组白细胞毒素蛋白对鼠的免疫保护作用均优于天然的白细胞毒素蛋白。为了检测5个重组白细胞毒素蛋白对坏死梭杆菌白细胞毒素靶细胞即反刍动物中性粒细胞的细胞凋亡作用，利用流式细胞术对5个重组蛋白的细胞凋亡作用进行了分析，结果显示：5个重组白细胞毒素蛋白对羊中性粒细胞均具有凋亡作用，但是这种凋亡作用明显低于天然白细胞毒素蛋白。本研究主要内容如下：1．采用PCR方法设计五段彼此相互重叠、覆盖全长F．necrophorum白细胞毒素基因（lktA）的引物，从F．necrophorum A25菌株（羊源）和H05（牛源）菌株中分别扩增了lktA基因（lktA1、lktA2、lktA3、lktA4和lktA5），测序、拼接后与GenBank发表的F．necrophorumA25菌株白细胞毒素基因核甘酸序列进行比对分析，结果显示，扩增的A25菌株和H05菌株的lktA基因与GenBank发表的lktA基因的核甘酸同源性分别为99.82％和99.75％，推导的氨基酸同源性分别为99.72％和99.63％。说明lktA基因在牛羊之间是非常保守的，这为我国牛、羊腐蹄病F．necrophorum白细胞毒素重组亚单位疫苗的研制奠定了物质基础。2．利用pET-28a、pET-30a、pET-32a、pQE30、pPRO-EX-HTa和pGEX-6p-1原核表达载体构建了一系列表达5个截短F．necrophorum lktA基因的重组质粒，阳性质粒转化E．coliBL21（DE3）或E．coli RosettaTM（plyss）后，用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明，lktA3片段在pPRO-EX-HTa原核表达系统中获得了表达，而lktA1、lktA2、lktA4和lktA5片段在上述前5种原核表达载体中均不能表达。为了将未表达的四个片段进行再次截短表达，同时保证表达片段具有良好的抗原性，本试验利用DNAstar Protean程序预测了lktA1、lktA2、lktA4和lktA5片段的主要抗原表位区，分别命名为PL1、PL2、PL4和PL5。按照相同的方法，构建了这四个片段一系列原核表达载体，诱导表达后发现，PL1、PL2、PL4和PL5片段在pGEX-6p-1原核表达系统中都获得了表达。lktA3重组蛋白以及PL1、PL2、PL4和PL5重组蛋白分别用B-PER（?）6×His Spin Purification kit和B-PER?GST Spin Purification Kit进行了纯化。Western-blot分析表明，5种融合蛋白均与坏死梭杆菌多克隆血清反应，表现出良好的免疫反应性。3．将PL1重组蛋白（疫苗Ⅰ）、PL2重组蛋白（疫苗Ⅱ）、lktA3重组蛋白（疫苗Ⅲ）、PL4重组蛋白（疫苗Ⅳ）和PL5重组蛋白（疫苗Ⅴ）分别作为重组亚单位疫苗，以天然白细胞毒素灭活疫苗作为免疫阳性对照组（疫苗Ⅵ），PBS作为免疫空白对照组，进行小鼠的免疫攻毒保护试验。共免疫4次，每次间隔15天，第4次免疫后第3天，以强毒株F．necrophorum（5×108CFU／ml）进行攻毒。通过血清特异性抗体水平，结合攻毒后小鼠的存活率和肝脏病理变化综合评价重组亚单位疫苗的免疫保护效果。结果显示，疫苗Ⅰ组、疫苗Ⅱ组、疫苗Ⅲ组、疫苗Ⅳ组和疫苗Ⅴ组的抗体效价水平均明显高于免疫对照组和疫苗Ⅵ组，其中疫苗Ⅰ组、疫苗Ⅱ组、疫苗Ⅲ组、疫苗Ⅳ组和疫苗Ⅴ组对F．necrophorum攻毒的保护率（6／6）和疫苗Ⅵ组对F．necrophorum攻毒的保护率（5／6）明显高于免疫对照组（3／6）。对F．necrophorum攻击后的肝脏保护疫苗Ⅰ组、疫苗Ⅲ组和疫苗Ⅳ组，明显优于免疫对照组，疫苗Ⅱ组、疫苗Ⅴ组和疫苗Ⅵ组介于前三组和免疫对照组之间，疫苗Ⅱ组、疫苗Ⅴ组对肝脏的保护优于疫苗Ⅵ组。4．PL1、PL2、lktA3、PL4、PL5重组蛋白以及天然白细胞毒素介导的羊中性粒细胞凋亡的流式细胞术检测结果表明：天然白细胞毒素蛋白对中性粒细胞的凋亡作用明显高于所有的表达的重组白细胞毒素蛋白（p＜0.01）；在重组白细胞毒素蛋白中，PL1、lktA3对中性粒细胞的凋亡作用较强；每个重组蛋白随着浓度的增高，凋亡作用逐渐增强。