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背景：
卵巢癌是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一,死亡率居妇科恶性肿瘤之首并且诊断困难。卵巢癌术后治疗以化疗为主,但卵巢癌患者在经过一段时间的化疗后会表现出对化疗药物的耐药性。已知人类肿瘤细胞对多种互不联系的不同结构和特异性作用的药物存在交叉耐药,这种现象被称为多药耐药(Multidrug resistance,MDR),使化疗不能达到理想效果。探索卵巢癌的发病机制,逆转卵巢癌细胞的多药耐药性,提高卵巢癌患者对化疗的敏感度成为一个需迫切解决的问题。卵巢癌细胞的abcb1基因编码的170-kDa的跨膜糖蛋白MDR－1(multidrug resistance－1),是其对生物碱(Alkafoid)、蒽环类抗生素[阿霉素(Adriamyein,ADM)和柔红霉素(Daunomyein,DAM)]以及紫杉烷类(Taxanes)等天然抗肿瘤药物产生耐药性的重要原因之一。
研究显示,肿瘤是一种干细胞疾病。肿瘤组织中存在极少量的肿瘤干细胞(Tumor StemCells,TSCs)或癌干细胞(Cancer-Stem Cells,CSCs),具有无限增生的潜能,自我更新能力,对化疗、放疗具有抗性,是肿瘤发生、发展、侵袭、转移、复发及耐药的决定性因素。TSCs和干细胞的相似处之一就是同样高表达ATP结合框转运体(ATP-binding cassettetransporters,ABC)转运体。ABC转运体是干细胞自我保护的重要机制之一,在肿瘤的多药耐药性方面也起着重要的作用。因而,本研究利用RNA干扰(RNA interfere,RNAi)的方法,来降低MDR-1在卵巢癌细胞中的表达,并研究MDR-1表达降低对卵巢癌细胞耐药性的改变,并期望能探索其对卵巢癌干细胞的影响。
目的:
探讨shRNA抑制卵巢癌细胞系A2780中abcb1基因表达及逆转A2780细胞多药耐药性的可行性。
方法：
1:RT-PCR检测卵巢癌A2780细胞系中abcb1基因(Genbank序号:NM_000927)的表达；
2:按照设计规则合成三对靶向abcb1的干扰序列和一对阴性对照序列,退火转变成双链shRNA。以pSUPER-EGFP1质粒为载体构建真核表达载体；
3:用脂质体Lipofectamin2000将pSUPER-EGFP1-MDR1-shRNAs、pSUPER-EGFP1-scramble-shRNA、psuPER-EGFP1质粒转染入A2780细胞,用含G-418的1640培养液筛选转染阳性、表达绿色荧光蛋白的单克降细胞株。
4:q-PCR、Western blot分别检测A2780细胞及稳定转染的细胞abcb1mRNA、MDR-1蛋白的表达；
5:MTT法检测A2780细胞和abcb1下调的A2780细胞对长春新碱、紫杉醇的耐药性；
6:平板克隆形成实验检测肿瘤细胞的克隆形成能力；
7:抗肿瘤药紫杉醇等治疗Balb／c裸鼠卵巢肿瘤,检测细胞及稳定转染的细胞系对化疗药物的敏感性。
结果：
1.RT-PCR从A2780细胞中成功扩增出abcb1基因；
2.琼脂糖凝胶电泳显示成功构建三个干扰质粒pSUPER-EGFP1-MDR1-shRNAs及阴性对照质粒pSUPER-EGFP1-scramble-shRNA；
3.成功转染并筛选出单克降细胞株A2780-plasmid、A2780-scramble-shRNA、A2780-MDR1-shRNA1、A2780-MDR1-shRNA2、A2780-MDR1.shRNA3。
4.q-PCR和Western blot结果显示A2780-MDR1.shRNA2、A2780-MDR1-shRNA3中MDR-1蛋白的表达受到抑制
5.MTT检测细胞的耐药性显示:转染了干扰质粒的单克降细胞株A2780-MDR1-shRNA2对化疗敏感性增强。
6.平板克降形成实验表明:各细胞株之间的克降形成能力没有显著差异。
7.A2780-MDR1-shRNA2克隆细胞株在裸鼠皮下形成的肿瘤对紫杉醇化疗较其他各组更为敏感。
结论:
靶向abcb1的干扰质粒pSUPER-EGFP1-MDR1-shRNA2可以下调MDR-1的表达。降低A2780细胞对长春新碱、紫杉醇耐药性,但不影响肿瘤细胞的克降形成能力。本研究提示:shRNA下调abcb1基因可减低MDR1表达,部分地逆转A2780细胞多药耐药性,增强卵巢癌患者对化疗的敏感性,提高治愈率。