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自交不亲和性是一种基于遗传的种内生殖障碍,广泛存在于高等植物中,以抑制近亲繁殖而促进杂交。最近,茄科类型自交不亲和反应中的花粉决定因子被鉴定为SLF(S-locusFox)/SFB(S-haplotype-specificF-box)一类F-box蛋白,因而被推测可能存在相应的SCFSLF/SFB复合体特异性的识别花柱决定因子S核酸酶并通过泛素化抑制其细胞毒性。然而,在茄科和蔷薇科中存在的不同遗传证据导致了对这一模型正确性或普适性的争论。在本论文工作中,我们利用酵母双杂交技术分离到与AhSLF-S2互相作用的两类蛋白:SSK1((S)LF-interacting(SK)P1-like1)和ULA((u)biquitin-(l)ikeandubiquitin-(a)ssociated)。AhSSK1是一类在花粉中特异表达的SKP1类似蛋白,可以与AhSLF在酵母和植物中特异作用。生化实验结果表明,AhSSK1可以与AhSLF和CUL1类似蛋白形成SCF复合体而靶向S核酸酶。SSK1也是花粉中第二个被鉴定与茄科类型自交不亲和反应直接相关的基因。为了对SSK1基因进行遗传学研究,我们从金鱼草这一不能转化的植物转向有着相似自交不亲和机制的植物矮牵牛,并克隆到AhSSK1的候选同源基因PhSSK1。对这两个SSK1和其他植物SKP1基因蛋白序列比对和系统进化分析的结果表明,SSK1代表着一类新的SKP1基因亚家族,而且在拟南芥和水稻中没有同源基因,可能仅对茄科类型自交不亲和反应是必需的。SSK1-SLF可能代表着一种全新的SKP1-F-box作用范式。与系统进化分析结果一致的是,SSK1的显性抑制载体对金鱼草和矮牵牛的转化(前者使用基因枪轰击花粉方法)并不影响花粉的正常发育。目前PhSSK1的RNAi转化植株也已得到,其授粉表型分析因其他基因型自交不亲和矮牵牛体系正在建立而有待进行。
ULA蛋白可与AhSLF在酵母中作用。ULA代表着一类泛素链结合蛋白,可能负责将泛素化的底物蛋白转运至26S蛋白酶体。其相关研究在酵母中刚刚兴起,还未在植物中展开。我们也对ULA在拟南芥中的同源基因进行了反向遗传学研究。拟南芥中存在两个在染色体上呈串联排列的ULA基因,且表达量非常高,因而其T-DNA插入突变体和CaMV35S启动子过表达植株均无明显异常表型。两个基因的RNAi植株则表现出有多个主花序,莲座叶向顶生长和略为早衰等现象。这意味着,ULA可能因参与泛素一蛋白酶体途径而影响多个通路,如顶端分生组织发育和植物激素反应等。另外,对拟南芥ULA启动子的分析表明,一个至多307bp的片段即可驱动基因强劲的组成型表达。这些结果表明SLF能够形成一种新的SCF复合体参与自交不亲和反应。