论文部分内容阅读
禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起的主要感染禽类的传染病,可分为低致病性禽流感和高致病性禽流感。以H9N2亚型禽流感为代表的低致病性禽流感,发病后致死率低,但感染后往往引起免疫力下降,易产生继发感染导致生产性能降低,因此它对养禽业造成的经济损失相当严重。现存的H9N2亚型禽流感诊断方法主要为传统的病原学分离、血清学和RT-PCR诊断等,但因为耗时较长,对仪器设备要求较高等而不利于现场快速诊断。本研究的目的是制备出抗H9N2亚型禽流感病毒X-19流行株的单克隆抗体,为H9N2亚型禽流感的快速诊断和研究奠定基础。实验采用了H9N2亚型禽流感病毒X-19株作为抗原来制备单克隆抗体。将H9N2亚型禽流感病毒X-19株接种SPF鸡胚尿囊腔,传代至第三代,收获X-19株禽流感病毒,测定HA效价为10log2。使用差速离心方法浓缩病毒,使X-19病毒的HA效价从10log2增加到13log2。用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒,可见病毒亮带出现在蔗糖密度30%与60%之间。将浓缩的X-19病毒灭活,与佐剂混合后,按免疫程序接种6周龄的Balb/c小鼠。使用纯化的X-19病毒为包被抗原,以确定的最佳包被浓度、最佳反应时间等建立间接ELISA方法,测定小鼠的血清抗体水平。当小鼠抗体水平超过1:102400时,采集小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤NS0细胞进行细胞融合。使用已建立的ELISA方法对阳性孔进行筛选,阳性孔的细胞通过3次有限稀释亚克隆后,得到6株能稳定分泌抗H9N2亚型禽流感病毒X-19株的杂交瘤细胞株,分别命名为1A7、2B11、2C9、8F3、4F3、3B9。使用ELISA和HI实验分别检测6株杂交瘤细胞的上清和腹水,除了2C9外,其余的5株杂交瘤细胞HI值均高于6log2,腹水HI效价值高于8log2,ELISA方法检测的细胞上清效价在1:800~1:6400之间,腹水的效价在1:3200~1:51200之间。对单克隆抗体进行特异性鉴定,结果表明,它只与禽流感H9N2亚型X-19株反应,不与IBDV、SIV、NDV、FADV、IBDV反应,说明制备的单克隆抗体特异性高。将6种单抗与6株不同H9亚型禽流感病毒反应,发现8F3与4株H9亚型禽流感病毒反应呈阳性,可以初步判定其反应谱较广,推测其特异性识别H9亚型禽流感病毒的某个保守位点,有待进一步试验验证。间接荧光实验可见6株单抗均有较亮的免疫荧光,具有较好的免疫活性,具备制成H9亚型禽流感病毒快速检测试剂盒的潜力。