论文部分内容阅读
【目的】本研究旨在从人脐带血中培养和扩增内皮祖细胞,同时对内皮祖细胞活性进行刺激,观察移植扩增处理后的内皮祖细胞对缺血下肢的影响,为脐血内皮祖细胞移植治疗下肢缺血性疾病提供实验依据。【方法】1、取健康孕妇分娩后脐血,以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,接种于包被有人纤维连接蛋白的培养板中,2天后收集悬浮细胞重新贴壁培养到第7天,观察细胞生长情况,并对贴壁细胞通过免疫组化、免疫荧光和流式细胞技术进行鉴定,证明其为内皮祖细胞。2、7天后消化收集内皮祖细胞,将细胞制成细胞悬液,加入24孔培养板,分别按照不同基础培养基种类（M199、EGM-2、DMEM）,不同细胞接种密度（1×103、1×104、1×105/cm2）,不同胎牛血清浓度（5%、10%、20%）和不同细胞因子组合（VEGF、VEGF+bFGF、VEGF+bFGF +EPO）等条件进行培养,实验按L9（34）正交设计分组。7天后计算细胞个数,统计细胞扩增倍数,筛选出令细胞扩增倍数最多的培养条件,并对扩增后的内皮祖细胞进行表面标志、免疫荧光和血管形成功能鉴定。分别用10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的SDF-1处理扩增后的内皮祖细胞,并设对照组,应用改良的Boyden小室测定细胞的迁移能力,并测定细胞的黏附能力。3、建立缺血后肢动物模型,随机分4组,分别为局部移植EPCs（A组）,扩增后的EPCs+ SDF-1（B组）、SDF-1（C组）和细胞培养液（D组）,移植后进行肢体缺血评估,观察缺血裸鼠后肢皮肤色泽,检测皮温差,统计后肢保肢率,观察缺血肌肉血管新生情况,分析扩增处理内皮祖细胞对移植效率的影响。【结果】1、脐血单个核细胞培养第5天可见贴壁细胞呈集落样生长,10天后大多数细胞呈梭形,第21天可见铺路石样结构。第7天的贴壁细胞吞噬DiI-acLDL后,在倒置显微镜下观察呈红色荧光;结合FITC-UEA-1后呈绿色荧光;双染色阳性细胞为黄色荧光,倒置显微镜下计数双染色阳性细胞>75%。流式细胞仪检测CD34阳性表达率为51.4%,CD133阳性表达率为28.7%,VEGFR-2阳性表达率为82.8%,FVIII因子阳性率>80%。2、内皮祖细胞经各种条件培养后数量均有增加,各因素对扩增细胞的作用为细胞因子>基础培养基>胎牛浓度>接种密度,在接种密度为1×104/cm2,含5%的FBS及添加了细胞因子（VEGF+bFGF+EPO）的M199培养液里内皮祖细胞扩增倍数最多,可达80余倍。扩增后的内皮祖细胞CD34、CD133、VEGFR-2阳性表达率为分别为41.6%、23.6%和88.3%,免疫荧光双染色阳性细胞>65%,Ⅷ因子阳性表达率>85%。内皮祖细胞在体外ECMatrixTM上孵育可以形成网状血管样结构。内皮祖细胞迁移实验和粘附实验显示,对照组、SDF-1浓度分别为l0ng/ml,50ng/ml,100ng/ml时,细胞迁移数分别为19.33±2.02个,29.33±1.45个,71.66±3.48个和88.66±2.60个,细胞的粘附个数分别为29.3±1.52个,44.6±2.51个,74.6±2.51个和84.0±3.00个。SDF-1各浓度的细胞迁移数和粘附数与对照组比较均有显著性差异（P<0.05）,10ng/ml组与50ng/ml组、50ng/ml组与100ng/ml组相比较,P<0.05。3、28天后,经过处理的裸鼠后肢缺血评分平均为A组1.9分、B组1.4分、C组2.4分和D组2.5分;后肢保肢率为A组40%、B组保肢率为60%、C组保肢率为20%、D组保肢率为20%;术后14 d、28 d,缺血裸鼠后肢皮温差A组、B组较D组明显减少（P<0.05）,B组较A组明显减少（P<0.05）,均具有统计学意义;术后28 d,四组肌肉毛细血管密度分别为3.94±1.26、5.63±1.22、2.52±0.87、2.37±0.66,A组、B组毛细血管密度显著大于D组（P<0.05）,B组大于A组（P<0.05）,均有统计学意义,而C组与D组无明显统计学意义。【结论】1、通过体外扩增的方法能从脐带血中获取足够数量的内皮祖细胞,内皮祖细胞在接种密度为1×104/cm2,含5%的胎牛血清及添加了细胞因子VEGF+bFGF +EPO的M199培养液里扩增倍数最多;2、SDF-1增加内皮祖细胞的迁移和粘附能力并具有剂量依赖性,在体内促进内皮祖细胞归巢;3、内皮祖细胞能通过增加裸鼠缺血后肢的血管密度来改善下肢缺血的症状;4、采用体外扩增与刺激的处理方法可以克服内皮祖细胞数量不足问题,提高脐血干细胞的移植效率。