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目的:随着越来越多的化学物进入人类的生产和生活,如何对化学物潜在的毒性进行安全性评价,成为当今全球广泛关注的问题。一般传统的动物实验,存在实验周期较长,影响因素复杂等诸多方面问题;而体外实验缺乏各种生理屏障,不具备体内代谢作用等缺点,影响了结果外推到人。本实验拟通过建立体外细胞模型替代方法,克服目前体外实验的缺点,对外源化合物的毒性进行更为快速准确的评价。方法:1体外血脑屏障(blood brain barrier,BBB)模型的建立和验证:免疫印迹法测定人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞的紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin-1和Claudins的表达。用HUVEC和胶质瘤细胞(C6),通过非接触式共培养,建立体外BBB模型。用Millicell-ERS仪测定共培养模型的跨内皮阻抗(Trans-endotheilal electrical resistance,TEER)验证BBB的紧密连接性,用辣根过氧化物酶(HRP)的示踪效应验证BBB的通透性。2多器官细胞共培养(integrate discrete multiple organ cell co-culture,idMOC)模型的建立和验证:采用自制的多器官细胞共培养板。在十二孔板中,每四个孔为一组,在距离孔板底部一定高度处进行打孔,各孔间可互相连通。培养时,将HK-2细胞、L-02细胞和SH-SY5Y细胞接种于自制的多器官细胞共培养板的不同孔中,并使其互相连通,观察HK-2细胞、人L-02肝细胞和SH-SY5Y细胞生长情况,建立共培养模型。每天取三块共培养的细胞培养板和三块单培养的细胞培养板,进行检测直至第四天。CCK-8法分别测量共培养和单独培养下的生长曲线,观察共培养条件下各组织细胞与单独培养条件下生长曲线是否一致,确定idMOC模型是否建立成功。3 BBB和idMOC模型的应用:以140μg/ml、270μg/ml浓度的丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)对SH-SY5Y直接染毒;ACR经BBB后,取孔板内全部培养基对SH-SY5Y染毒;以及ACR在idMOC条件下对SH-SY5Y染毒,流式细胞分析不同处理条件下SH-SY5Y细胞晚期凋亡率的变化,探索BBB和idMOC体外模型的应用。结果:1体外BBB模型的建立1.1体外BBB模型的建立BBB形成的结构基础在于内皮细胞间形成紧密连接(tight junction,Tj),本实验对所用细胞株HUVEC的Tj相关蛋白Occludin、claudins和ZO-1免疫印迹结果显示呈高表达,可以用来构建体外BBB模型。本实验通过共培养的方法成功建立了HUVEC单细胞模型和HUVEC细胞与C6细胞的共培养模型。1.2体外BBB模型的验证HUVEC在C6胶质细胞的作用下,细胞间可以形成广泛的紧密连接复合体进而抑制外加电场下电流的跨内皮运动,产生了高达235Ω/cm2的TEER值;并且TEER值均数在4、5、6 d时均高于内皮细胞单独培养组,差异有显著性意义(P<0.05)。一般而言TEER值越大,说明BBB的通透性愈小,其屏障功能愈好。HRP与底物反应后产生显色反应,在450 nm的吸光度(D450)与HRP浓度具有良好的线性关系,说明在60 min的测试过程中各模型的性能稳定。在20 min后各时间点HRP的累计清除量(△TCl)共培养组均小于单独培养组,差异有显著性意义(P<0.05),表明共培养组的屏障功能高于单独培养组。2体外idMOC模型的建立:2.1 idMOC模型的建立利用自制的多器官细胞共培养板,建立了稳定的idMOC模型。各种细胞间可通过培养板的交换孔进行物质交换,细胞生长状态良好,无明显死亡。通过该共培养模型,模拟了物质在体内经肝脏和其他代谢器官的代谢过程。2.2 idMOC模型的验证通过共培养组与单独培养相比,共培养组细胞与单独陪养组相比生长曲线基本一致,差异无统计学意义(P>0.05)。3 BBB和idMOC模型的应用:利用ACR对SH-SY5Y细胞直接染毒、和经过BBB和idMOC模型后染毒,观察晚期凋亡率。140μg/m L、270μg/m L ACR直接染毒组,晚期凋亡率分别为(23.53±1.80、82.57±2.56);ACR经BBB后染毒组,晚期凋亡率分别为(20.27±0.57、73.83±0.76);经idMOC模型染毒组,晚期凋亡率从分别为(12.73±1.00、52.73±1.56%)。不同浓度ACR经过BBB和idMOC模型后染毒,对SH-SY5Y细胞的毒性作用显著降低。结论:1成功建立了基于HUVEC细胞和C6细胞共培养体系的体外BBB模型。2成功建立了以HK-2细胞、人L-02肝细胞和SH-SY5Y细胞共培养为基础的体外idMOC代谢模型。3不同浓度ACR经过BBB和idMOC模型后染毒,对SH-SY5Y细胞的毒性作用显著降低,说明体外BBB的屏障效应和体外idMOC模型的代谢可以减弱ACR毒性的作用。