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目的：
通过亲和“垂钓”、蛋白质质谱鉴定以及亲和力分析，前期发现肌酸激酶(CK-MM)是人参皂苷在骨骼肌组织内的作用靶点，并且该靶点与原形人参皂苷没有相互作用，而与人参次皂苷及苷元有相互作用，其中以与原人参二醇(PPD)的亲和作用最强。在此基础上，本实验进一步采用了多种亲和检测方法对PPD与CK-MM之间的相互作用进行确证，并基于该靶点阐释人参皂苷抗物理疲劳的药效。
方法：
实验1：原人参二醇与肌酸激酶亲和常数的测定
采用生物膜层干涉技术(BLI)、微量热泳动技术(MST)和等温滴定量热技术(ITC)精确测定PPD与CK-MM之间的各类亲和常数，包括亲和力(KD)、结合剂量比(n)、焓变(⊿H)、熵变(⊿S)，确证两者之间的关系。
实验2：原人参二醇与肌酸激酶的分子对接
基于分子对接软件，允许PPD和CK构象自由变化，计算对接结果，探讨PPD与CK的结合位点和结合模式，为两者之间的相互作用进一步提供佐证数据。
实验3：原人参二醇体外对肌酸激酶活性的影响
选择三种不同品系来源的CK-MM：人源CK-MM、兔源CK-MM以及小鼠骨骼肌匀浆液，将其与不同浓度的PPD混合，分析PPD对CK-MM活性的影响。
实验4：原人参二醇体内对肌酸激酶活性的影响
给予小鼠PPD灌胃后，取双后肢的骨骼肌，采用肌酸激酶试剂盒测定骨骼肌匀浆液中CK-MM的酶活，采用蛋白印迹法(Wester-Blot，WB)和Q-PCR法分析CK-MM的表达，以及采用高效液相色谱法(HPLC)测定组织中磷酸肌酸的含量，探索PPD与CK-MM结合后在体内产生的生物效应。
实验5：原人参二醇对小鼠能量代谢的影响
正常小鼠给予PPD灌胃，比较小鼠负重游泳前后骨骼肌组织中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)、磷酸肌酸以及乳酸的含量，分析原人参二醇是否有助于延缓组织中乳酸的生成。
实验6：原人参二醇对小鼠负重游泳和低张性缺氧的影响
通过小鼠的窒息实验以及负重游泳实验，验证PPD是否具有预防涉及能量代谢的病理生理过程的药效。
结果：
实验1：
BLI技术检测表明，PPD与CK-MM之间的亲和力(KD)值为2.53×10-5M：ITC技术检测得出两者结合平衡常数(K)为5.38±0.924×105M-1，反应结合比(N)为1.05±0.0212Sites，焓值的变化(⊿H)为-3494±95.70cal/mol，熵值的变化(⊿S)为14.5cal/mol/deg;MST技术测出两者结合的Kd为1.34±0.179×10-7M。
实验2：
FTMap分析发现，PPD与肌酸激酶具有三个潜在的结合位点，除ADP位点外(S1、S1’和S1”)，尚有邻近位点(S2、S2’和S2”)以及二聚体相互作用面;采用Schr(o)dinger软件平台的Glide模块对原人参二醇与这几个潜在结合位点进行了分子对接模拟，发现原人参二醇倾向于结合在$2/S2”位点。原人参二醇可通过羟基、羧基与His191、Glu231、Glu232形成氢键(S2)或与Arg320、Gln318、Ser285形成氢键(S2”)。
实验3：
不管是鼠源性、人源性还是兔源性的CK-MM，PPD体外均可提高其酶活，最大提高幅度约10％左右。不过，PPD的浓度与CK-MM的酶活之间不是线性关系，而是呈倒“U”的关系：随着体外PPD的浓度逐步提高，酶活逐步上升，但是再增加PPD的浓度，酶活开始下降。
实验4：
PPD灌胃给药对骨骼肌组织中CK-MM的蛋白表达和mRNA表达均没有明显影响，但高剂量PPD可提高肌组织中CK-MM的酶活，提高幅度约5％左右;与此同时，PPD可剂量依赖性地提高骨骼肌组织中磷酸肌酸的含量，最大提高幅度约10％左右。
实验5：
对于空白组小鼠，与游泳前相比，游泳后骨骼肌组织中乳酸的含量明显升高，约48％;对于给药组小鼠，与游泳前相比，游泳后骨骼肌组织中乳酸的含量也明显升高，约18％。与空白组小鼠相比，给药组小鼠在游泳前骨骼肌组织中磷酸肌酸的含量以及能量储存指数较高;游泳后，空白游泳组的小鼠的能量储存指数以及ATP/ADP的比值均比给药游泳组低。
实验6：
与空白组相比，PPD可明显延长小鼠负重游泳的时间和窒息致死亡的时间。窒息实验中，低、中以及高剂量组小鼠的生存时间分别延长了7.6％、12.9％以及15.3％;负重游泳实验中，中以及高剂量组小鼠的游泳时间多了37.3％以及42.5％。
结论：
1.CK-MM为人参皂苷在骨骼肌组织中的作用靶点，PPD是与该靶点结合活性较好的人参皂苷在体内的代谢产物之一。
2.PPD与CK-MM结合后，可提高CK-MM的酶活。当机体处于相对静止时，CK-MM酶活的提高，可增加组织中磷酸肌酸的含量，提升机体的能量储备;当机体处于耗能状态时，提高的能量储备可给机体提供额外的能量支持，并延缓机体乳酸的生成，拮抗缺氧以及高耗能刺激诱导的病理生理进程。
通过亲和“垂钓”、蛋白质质谱鉴定以及亲和力分析，前期发现肌酸激酶(CK-MM)是人参皂苷在骨骼肌组织内的作用靶点，并且该靶点与原形人参皂苷没有相互作用，而与人参次皂苷及苷元有相互作用，其中以与原人参二醇(PPD)的亲和作用最强。在此基础上，本实验进一步采用了多种亲和检测方法对PPD与CK-MM之间的相互作用进行确证，并基于该靶点阐释人参皂苷抗物理疲劳的药效。
方法：
实验1：原人参二醇与肌酸激酶亲和常数的测定
采用生物膜层干涉技术(BLI)、微量热泳动技术(MST)和等温滴定量热技术(ITC)精确测定PPD与CK-MM之间的各类亲和常数，包括亲和力(KD)、结合剂量比(n)、焓变(⊿H)、熵变(⊿S)，确证两者之间的关系。
实验2：原人参二醇与肌酸激酶的分子对接
基于分子对接软件，允许PPD和CK构象自由变化，计算对接结果，探讨PPD与CK的结合位点和结合模式，为两者之间的相互作用进一步提供佐证数据。
实验3：原人参二醇体外对肌酸激酶活性的影响
选择三种不同品系来源的CK-MM：人源CK-MM、兔源CK-MM以及小鼠骨骼肌匀浆液，将其与不同浓度的PPD混合，分析PPD对CK-MM活性的影响。
实验4：原人参二醇体内对肌酸激酶活性的影响
给予小鼠PPD灌胃后，取双后肢的骨骼肌，采用肌酸激酶试剂盒测定骨骼肌匀浆液中CK-MM的酶活，采用蛋白印迹法(Wester-Blot，WB)和Q-PCR法分析CK-MM的表达，以及采用高效液相色谱法(HPLC)测定组织中磷酸肌酸的含量，探索PPD与CK-MM结合后在体内产生的生物效应。
实验5：原人参二醇对小鼠能量代谢的影响
正常小鼠给予PPD灌胃，比较小鼠负重游泳前后骨骼肌组织中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)、磷酸肌酸以及乳酸的含量，分析原人参二醇是否有助于延缓组织中乳酸的生成。
实验6：原人参二醇对小鼠负重游泳和低张性缺氧的影响
通过小鼠的窒息实验以及负重游泳实验，验证PPD是否具有预防涉及能量代谢的病理生理过程的药效。
结果：
实验1：
BLI技术检测表明，PPD与CK-MM之间的亲和力(KD)值为2.53×10-5M：ITC技术检测得出两者结合平衡常数(K)为5.38±0.924×105M-1，反应结合比(N)为1.05±0.0212Sites，焓值的变化(⊿H)为-3494±95.70cal/mol，熵值的变化(⊿S)为14.5cal/mol/deg;MST技术测出两者结合的Kd为1.34±0.179×10-7M。
实验2：
FTMap分析发现，PPD与肌酸激酶具有三个潜在的结合位点，除ADP位点外(S1、S1’和S1”)，尚有邻近位点(S2、S2’和S2”)以及二聚体相互作用面;采用Schr(o)dinger软件平台的Glide模块对原人参二醇与这几个潜在结合位点进行了分子对接模拟，发现原人参二醇倾向于结合在$2/S2”位点。原人参二醇可通过羟基、羧基与His191、Glu231、Glu232形成氢键(S2)或与Arg320、Gln318、Ser285形成氢键(S2”)。
实验3：
不管是鼠源性、人源性还是兔源性的CK-MM，PPD体外均可提高其酶活，最大提高幅度约10％左右。不过，PPD的浓度与CK-MM的酶活之间不是线性关系，而是呈倒“U”的关系：随着体外PPD的浓度逐步提高，酶活逐步上升，但是再增加PPD的浓度，酶活开始下降。
实验4：
PPD灌胃给药对骨骼肌组织中CK-MM的蛋白表达和mRNA表达均没有明显影响，但高剂量PPD可提高肌组织中CK-MM的酶活，提高幅度约5％左右;与此同时，PPD可剂量依赖性地提高骨骼肌组织中磷酸肌酸的含量，最大提高幅度约10％左右。
实验5：
对于空白组小鼠，与游泳前相比，游泳后骨骼肌组织中乳酸的含量明显升高，约48％;对于给药组小鼠，与游泳前相比，游泳后骨骼肌组织中乳酸的含量也明显升高，约18％。与空白组小鼠相比，给药组小鼠在游泳前骨骼肌组织中磷酸肌酸的含量以及能量储存指数较高;游泳后，空白游泳组的小鼠的能量储存指数以及ATP/ADP的比值均比给药游泳组低。
实验6：
与空白组相比，PPD可明显延长小鼠负重游泳的时间和窒息致死亡的时间。窒息实验中，低、中以及高剂量组小鼠的生存时间分别延长了7.6％、12.9％以及15.3％;负重游泳实验中，中以及高剂量组小鼠的游泳时间多了37.3％以及42.5％。
结论：
1.CK-MM为人参皂苷在骨骼肌组织中的作用靶点，PPD是与该靶点结合活性较好的人参皂苷在体内的代谢产物之一。
2.PPD与CK-MM结合后，可提高CK-MM的酶活。当机体处于相对静止时，CK-MM酶活的提高，可增加组织中磷酸肌酸的含量，提升机体的能量储备;当机体处于耗能状态时，提高的能量储备可给机体提供额外的能量支持，并延缓机体乳酸的生成，拮抗缺氧以及高耗能刺激诱导的病理生理进程。