草鱼α<,2>巨球蛋白的纯化、特性研究、基因扩增及其初步应用

• 作 者: 李凤玲
• 机 构: 南京农业大学
• 出 处: 南京农业大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 草鱼 α2巨球蛋白 诱导区 序列分析 提纯 特性 剑尾鱼 口服免疫 嗜水气单胞菌

α₂巨球蛋白（α₂M）是动物体内的一种非特异性免疫因子，在鱼类抵抗外来病原菌的入侵中具有重要作用。在研究草鱼对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila Ah）不易感的物质基础为α₂巨球蛋白的基础上，进一步研究其结构和功能。通过聚乙二醇分级沉淀、凝胶过滤和阴离子交换层析，从草鱼血浆中分离纯化了α₂M。在非变性条件下电泳，草鱼α₂M的电泳图谱表现为一条带；在变性条件下电泳，草鱼α₂M的电泳图谱表现为两条条带，表明草鱼α₂M由两种不同亚基组成，相对分子质量分别为95kD和80kD左右。 草鱼α₂M与人α₂M的理化性质基本相似，在蛋白酶的作用下，有活性的天然S型构象变成无活性的F型。蛋白酶抑制试验表明草鱼α₂M有较强的抑制细菌胞外蛋白酶的活性。免疫双向扩散试验结果表明，草鱼α₂M与人α₂M的抗原性不交叉。 从鲤鱼和草鱼肝脏中提取总RNA，通过对鲤鱼α₂M保守区和诱导区基因序列的分析，设计两对引物，分别用RT-PCR方法扩增并克隆了鲤鱼、草鱼的保守区α₂M基因序列和含有草鱼α₂M诱导区的一段基因。测定了草鱼α₂巨球蛋白诱导区基因序列并推测其氨基酸序列的一级结构，发现草鱼与鲤鱼的α₂巨球蛋白在诱导区差异很大。提示不同动物α₂M抑制胞外蛋白酶的差异性可能与诱导区的差异密切相关。 将致病性嗜水气单胞菌J-1株接种LB培养基，摇床培养180rpm，28℃，24h，90℃30min灭活制得全菌苗。另将上述培养物离心，取上清，经硫酸铵沉淀，透析，90℃30min灭活，制得毒素苗。分别在全菌苗和毒素苗中加入适量草鱼α₂M。用小型饲料机制备5种饲料，分别含有全菌苗、毒素苗、有草鱼α₂M的全菌苗、有草鱼α₂M的毒素苗及普通饲料。实验用剑尾鱼分成5组，每组30尾。用上述5种饲料口服免疫剑尾鱼，连续投喂15d后，再投喂普通饲料20d；对照组用普通饲料连续投喂-35天。而后用AhJ-1株50LD₅₀腹腔注射攻击，全菌苗组30尾剑尾鱼的相对保护率为43.3％，全菌苗+α₂M组的相对保护率为53.3％，毒素苗组的相对保护率为26.7％，毒素苗+α₂M组的相对保护率为30％，对照组全部死亡。试验结果表明，α₂M能够增强免疫效果，对剑尾鱼具有一定的保护力。