论文部分内容阅读
目的：结直肠癌是常见的恶性肿瘤，传统的手术、化疗、放疗等治疗方式已取得很大的进展，但仍有部分患者尤其是进展期结直肠癌死于术后复发、转移。研究表明，肿瘤在体内生存的一个重要因素是肿瘤细胞的免疫逃避机制，一方面肿瘤细胞的免疫原性弱，大多数肿瘤缺乏肿瘤特异性抗原(Tumor SpecificAntigen，TSA)，肿瘤相关性抗原(Tumor Associated Antigen，TAA)免疫原性较弱；另一方面是机体内对肿瘤的免疫应答所必须的抗原递呈细胞(AntigenPresenting Cell，APC)功能减弱，主要表现为特定APC表面MHC类分子、共刺激分子(CD80、CD86等)功能低下、表达减少或缺如。树突状细胞(DendriticCell，DC)是体内“专职的”APC，不仅参与“初始型”免疫反应，而且参与“获得性”免疫反应，是机体调节效应细胞对抗原产生免疫应答还是免疫耐受的中心环节，另外，研究表明在大多数肿瘤组织中DC数量减少，功能减弱，其浸润程度与患者生存率呈正相关，因而引起人们的强烈关注。本研究拟应用以聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)为诱导剂的细胞融合技术，将DC与结肠癌细胞株(Lovo细胞)融合，希望能上调DC表面分子的表达，从而增强其介导效应性T淋巴细胞活性的能力，对肿瘤细胞产生更强大的免疫抑制作用。在本研究中，我们对融合细胞生物学特性进行研究，观察其安全性及在体外对结肠癌细胞的杀伤作用，希望为其用于结肠癌的辅助治疗提供实验基础和理论依据。
方法：实验分为三部分，第一部分：融合细胞的制备。(1)应用密度梯度离心法从人新鲜外周血中分离出外周血单个核细胞(Peripheral BloodMononuclear Cell，PBMC)，加细胞因子：粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte/Macrophage Colony—stimulating Factor GM—CSF)、白细胞介素—4(Interleukin-4，IL—4)以及肿瘤坏死因子—α (Tumor Necrosis Factor—α，TNF—α)，体外定向诱导分化，七天后收获成熟的DC；(2)应用PEG将成熟DC与Lovo细胞诱导融合，HAT/HT选择性培养基筛选培养21天后，收获纯净的融合细胞；(3)倒置显微镜观察细胞形态。第二部分：融合细胞的生物学效应的研究。(1)描计细胞生长曲线；(2)流式细胞仪检测融合细胞的细胞表型，包括：CD80、CD83、CD86等；(3)克隆形成实验检测融合细胞的克隆形成率；(4)混合淋巴细胞反应H3法检测融合细胞刺激T淋巴细胞的增殖能力；(5)观察融合细胞在裸鼠体内成瘤活性；第三部分：融合细胞在体外对结肠癌细胞的杀伤效应，应用MTTs比色法检测融合细胞在体外介导效应T淋巴细胞对Lovo细胞的杀伤作用。
结果：第一部分：(1)人外周新鲜血提取的单个核细胞在体外经细胞因子定向诱导分化，可获得具备典型形态学特征的DC；(2)融合细胞体积明显大于单纯DC，细胞悬浮生长，细胞表面有许多短小突起，形状不规则。第二部分：(1)Lovo细胞具有明显的细胞倍增现象，而DC与融合细胞未出现细胞倍增现象，细胞数目稳定；(2)融合细胞表面分子CD80、CD83、CD86表达水平较单纯DC表面分子显著提高；(3)融合细胞及DC在琼脂平板上未出现细胞克隆现象，Lovo细胞则出现明显的克隆现象；(4)融合细胞可显著刺激效应T淋巴细胞增殖，与T淋巴细胞在1：1时能力最强，与对照组比较差异非常显著(P＜0.01)；(5)融合细胞在裸鼠体内不能形成种植瘤，而Lovo细胞种植21天后出现明显的肿瘤结节。第三部分：体外MTTs比色法检测，提示融合细胞介导效应细胞对Lovo细胞的杀伤率与对照组比较差异非常显著(P＜0.01)。
结论：(1)人的新鲜血提取的单个核细胞经细胞因子GM—CSF、IL—4以及TNF—a体外定向诱导分化，可获取成熟的DC；DC与Lovo细胞在PEG的诱导融合，HAT/HT选择培养后，可获得纯净的融合细胞。(2)融合细胞体积较亲代细胞明显增大，悬浮生长，分裂增殖能力弱，体外不能形成细胞克隆，在裸鼠体内不具有成瘤性。(3)、融合细胞表面分子表达较单纯DC显著提高，具有更强的刺激效应T淋巴细胞增殖的能力。(4)融合细胞在体外激活效应T淋巴细胞可对结肠癌细胞有显著的细胞毒性作用。