论文部分内容阅读
Phoma herbarum YS4108是我们课题组从海洋沉积物中分离到的一株丝状真菌。该菌能产生多种不同结构类型的、复杂的天然活性物质,包括具有强除草活性的聚酮类化合物herbarumin、含氮类植物毒素3-nitrophthalic acid、具有强烈血小板激活因子拮抗剂活性的萜类化合物phomactin(该属菌产生)以及我们课题组分离的一系列具有抗菌活性的聚酮类化合物、具有抗氧化活性的胞外多糖EPS和具有抗肿瘤活性的多糖YCP。但是由于缺乏基因水上的研究手段,更深层次的、关于这些化合物生物合成与调控的研究还是空白。
本论文研究内容包括紧密相关的两部分:(1)建立该菌高效的遗传转化系统,为这些天然活性物质的生物合成途径研究、基因克隆与基因工程奠定基础;(2)对该菌产生的抗肿瘤多糖YCP进行生物合成途径方面的研究。取得的结果有:
在遗传转化方面取得的结果及其意义:
(1)克隆了该菌内源性的甘油醛.3.磷酸脱氢酶(GPD)基因的启动子,利用该启动子构建了一系列转基因的载体,并成功地应用于转化实验,该启动子还将在今后的转基因研究方面发挥重要作用。
(2)建立了一种简便有效的、制备单细胞的方法,可以从P.herbaum YS4108的菌丝体直接制备单细胞用于遗传转化,解决了P.herbaum YS4108产孢难、原生质体制备难的问题。该方法值得在其它丝状真菌中尝试。
(3)根癌农杆菌介导的转化方法(ATMT法)和原生质体.PEG法都可以对P.herbarum YS4108进行转化,但是转化效率非常低,小于10个转化子/106个细胞。
(4)电穿孔法可以有效地转化P.herbarum YS4108,最佳的电击参数为电容25μF,电阻400Ω,电压0.75kV(0.2cm电击杯),按照本文方法制备的单细胞可以直接被转化,转化效率在80-90个转化子/106个细胞。
(5)首次将Tn5转座酶成功地应用到丝状真菌P.herbarum YS4108的遗传转化中,并使电穿孔法的转化效率提高到2.3倍,达到200个左右转化子/106个细胞。
本文所建立的单细胞制备方法和Tn5转座酶辅助的遗传转化(TNAT)技术在丝状真菌中都还未见报道。单细胞制备方法和TNAT技术可以结合起来形成一套完整的技术体系,有望成为一种新的、具有广泛适用性的插入突变工具用于丝状真菌的功能基因组学研究。
在YCP生物合成方面取得的的结果及其意义:
(1)建立了快捷高效地体外酶法合成YCP的方法,并通过一系列的底物和中间物实验,基本明确了YCP的生物合成途径,确定了YCP生源途径中的供体一UDPG和其脱氢衍生物UDPGA,解决了YCP侧链葡萄糖醛酸的引入机制问题-通过α-1,6-葡萄糖醛酸转移酶。由于体外合成的方法可以快速有效地鉴定参与该途径的反应物、催化酶类以及其它调控因子,因此必将成为研究YCP生物合成途径的一个重要工具。
(2)YCP侧链加葡萄糖醛酸的反应必须依赖于主链(或侧链)加葡萄糖的反应,说明负责侧链的葡萄糖醛酸转移酶和负责主链(或侧链)的葡萄糖转移酶存在相互作用,前者极有可能是通过后者的招募作用或桥连作用发挥功能。
(3)克隆了YCP生物合成途径中的一个关键酶-UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)的基因,利用E.coli表达系统对该酶进行了表达、纯化。体外合成实验发现,添加内源性UGPase1.6倍当量关系的重组UGPase可以使YCP的合成量提高18倍,说明UGPase极有可能是YCP生物合成途径中的限速酶,该结果无疑为今后通过基因工程法大幅度提高YCP的产量提供了可能。
(4)以简单的底物葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)、UTP、NAD+为原料,利用终浓度20μg/ml的粗酶液,添加终浓度3μg/ml的重组UGPase,37℃反应4 h,就能在体外高效地合成YCP,产率达到80μg/ml以上,葡萄糖的转化率达到了50％以上。YCP合成酶系的水溶性特点及体外酶法高效合成YCP的成功,显示了YCP组合化学酶法合成的光明前景。
(5)克隆了P.herbarum YS4108的糖原合成酶(GS)基因,为深入分析YCP途径与糖原合成途径的关系奠定了基础。
本文的结果为完全阐明YCP的生物合成途径以及相关基因的克隆奠定了良好的基础。