论文部分内容阅读
骨质疏松症和高血压病均是年龄相关的慢性疾病。它们在绝经后女性人群中发病率显著升高,可引发诸多的并发症,具有较高的致残率和致死率,严重威胁绝经后女性的健康,同时也消耗大量的社会资源,因此成为全球关注的公共健康问题。选择性β1肾上腺素能受体阻滞剂能够选择性地阻滞心血管系统的β1受体,降压效果显著且副作用少,是治疗高血压病的一线药物。临床流行病学研究表明,选择性β1肾上腺素能受体阻滞剂可以显著提高用药人群的骨密度、降低用药人群的骨折风险,对绝经后妇女亦有此效应,但缺乏相关的深入研究。因此研究选择性β1肾上腺素能受体阻滞剂对骨质疏松症的预防与治疗的确切疗效具有重要意义。研究目的:通过体外细胞学研究、体内动物实验,研究探索选择性β1肾上腺素能受体阻滞剂抗骨质疏松作用及相关的机制,为骨质疏松症的临床治疗提供新的方向和方法。研究方法:1.美托洛尔对成骨细胞增殖、分化能力影响及相关机制的研究对新生大鼠的颅骨采用“胰酶消化+骨组织块贴壁法”进行成骨细胞的培养,并对成骨细胞进行茜素红S染色鉴定。按培养基中加入美托洛尔(一种代表性选择性β1肾上腺素能受体阻滞剂)的不同浓度,将实验组分为空白对照组(0 mol/L)、低浓度组(1×10-6 mol/L)、中浓度组(1×10-5 mol/L)、高浓度组(1×10-4 mol/L),干预第3代成骨细胞,并进行研究。(1)细胞增殖采用噻唑蓝比色法(MTT)分别测试第1、4、7天美托洛尔对于成骨细胞增殖能力的影响。(2)细胞分化采用碱性磷酸酶(ALP)染色及ALP定量测试第1、4、7天美托洛尔对于成骨细胞分化能力的影响。采用茜素红S染色及定量测试第22、25、28天美托洛尔对于成骨细胞矿化能力的影响。采用Real time-PCR,分别测定第3、6、9天成骨相关基因的表达,包括Collagen 1(Col1a1)、ALP、Osteopontin(OPN)和Osteocalcin(OCN)。2.美托洛尔对破骨细胞分化及活性影响的研究在s RANKL的诱导下,将破骨细胞前体细胞RAW 264.7细胞诱导分化为破骨细胞。经镜下大体观察、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、电镜扫描骨吸收陷窝鉴定破骨细胞,确认培养成功。在含s RANKL的培养基中加入不同浓度美托洛尔,分为空白对照组(0 mol/L)、低浓度组(1×10-6 mol/L)、中浓度组(1×10-5 mol/L)、高浓度组(1×10-4 mol/L),诱导、干预RAW 264.7细胞,进行研究。(1)细胞增殖采用噻唑蓝比色法(MTT)分别测试第3、5、7天美托洛尔对RAW 264.7细胞增殖能力的影响。(2)TRAP活性采用TRAP酶活性定量法检测第5天美托洛尔对破骨细胞TRAP活性的影响。3、美托洛尔对去卵巢大鼠干预的研究雌性大鼠去势,建立绝经后骨质疏松模型。将32只雌性SD大鼠随机分为4组,每组8只:假手术组(Sham)、模型组(OVX+生理盐水)、低剂量组(OVX+美托洛尔,150 mg/kg/day)、高剂量组(OVX+美托洛尔,250 mg/kg/day)。术后4周开始行药物灌胃干预。连续药物干预12周后,利用双能X线骨密度仪测量动物L4椎体骨密度(Bone Mineral Density,BMD)。处死动物,收集L4、L5椎体及右侧股骨远端标本。对L4椎体采用生物力学试验机进行椎体压缩测试,根据载荷-位移曲线计算、记录极限载荷(Ultimate Load)、硬度(Stiffness)、能量吸收值(Energy Absorption)。对L5椎体进行切片、苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色后,显微镜下观察、照片。对右侧股骨远端松质骨部分进行显微CT扫描,重建三维图像、测量骨小梁显微结构参数。研究结果:1.美托洛尔对成骨细胞增殖、分化能力影响及相关机制的研究(1)细胞增殖各组成骨细胞的OD(Optical Density,光密度)值随时间推移而增多。第1天高浓度组的OD值显著高于空白对照组(P<0.05),第4、7天,中、高浓度组的OD值显著高于空白对照组(P<0.05)。中、高浓度美托洛尔具有促进成骨细胞增殖能力的作用。(2)细胞分化ALP染色及定量测试结果提示,成骨细胞的分化程度随时间推移而升高。第1、4天,高浓度组的ALP染色及定量分析结果优于空白对照组(P<0.05)。第7天,中、高浓度组的ALP染色及定量分析结果优于空白对照组(P<0.05)。茜素红S染色及钙结节定量测试得到类似的结果。第28天,低、中、高浓度组的成骨细胞钙结节染色及定量分析结果均优于空白对照组(P<0.05)。Real-time PCR检测成骨相关基因Col1a1、ALP、OPN及OCN的结果表明中、高浓度组的目标基因表达水平高于空白对照组(P<0.05)。中、高浓度美托洛尔具有促进成骨细胞分化能力的作用。2.美托洛尔对破骨细胞分化及活性影响的研究(1)细胞增殖与空白对照组相比,第3、5、7天,高浓度组的OD值显著低于空白对照组(P<0.05);第5、7天,中剂量组的OD值低于空白对照组(P<0.05)。中、高浓度美托洛尔具有抑制RAW 264.7细胞分化能力的作用。(2)TRAP活性TRAP定量测试结果提示,在中、高浓度组干预下,破骨细胞TRAP酶活性明显低于空白对照组(P<0.05)。中、高浓度美托洛尔具有抑制破骨细胞活性的作用。3.动物实验与OVX相比,美托洛尔干预组的L4骨密度下降的趋势得到了有效抑制(P<0.05);高剂量组的L4椎体生物力学参数,极限载荷、硬度、能量吸收值显著增高(P<0.05);股骨远端的骨小梁显微结构明显改善(P<0.05)。L5椎体HE染色切片、右侧股骨远端骨组织三维重建图像均提示美托洛尔干预组较OVX组有更优的骨小梁微结构。研究结论:美托洛尔通过调高成骨相关基因的表达水平促进成骨细胞的增殖和分化,抑制破骨细胞分化及其活性;通过对骨重建的调节,改善骨小梁微结构,提高力学强度;提供新的治疗绝经后骨质疏松合并高血压病的思路。