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绵羊支原体肺炎(Mycoplasma pneumonia,MP)是以咳嗽、喘气,渐进性消瘦及慢性增生性间质性肺炎为特征的绵羊慢性呼吸道传染病,致病机制比较复杂,临床诊断和防治比较困难。甘露糖结合凝集素(Mannan-binding lectin,MBL)作为天然免疫系统的一员,直接介导或通过凝集素途径激活补体,在机体天然免疫防御、免疫监视中发挥重要作用。目的:分析MBL蛋白在肺炎支原体感染引起的天然免疫中发挥的作用以及MBL蛋白在个体感染中的治疗效果,验证MBL蛋白与绵羊支原体肺炎的抗性关系。方法:(1)采集健康绵羊的肝脏,提取RNA,逆转录得到c DNA,设计引物扩增MBL编码区序列。经Eco RI和Hind III双酶切后,MBL目的基因和真核表达载体p TT5连接,构建绵羊MBL基因真核表达重组质粒p TT5-MBL,转染进CHO细胞和293细胞表达并分离纯化重组MBL蛋白。依据血清MBL分离纯化方法分离纯化绵羊血浆来源MBL蛋白。通过气管注射方法人工感染绵羊肺炎支原体,人工感染后每日观察其临床症状,人工感染14d时分别静脉注射重组MBL蛋白和血浆来源MBL蛋白,观察其临床症状,蛋白注射四周后宰杀。(2)在蛋白治疗-1d、7d、14d、21d、28d采集新鲜血液和血清,用ELISA方法和荧光定量PCR分析血清中MBL、TNF-α、IFN-γ、补体C1、C3、IL-2、IL-4的浓度变化和表达水平。(3)蛋白注射四周后对抗病组和易感组患病绵羊屠宰取样,采集肝脏组织,放入液氮储存,送生物公司进行mi RNA Hi Seq高通量测序,并对测序结果进行生物信息学分析,筛选差异mi RNA。结果:(1)成功构建了绵羊MBL基因真核表达载体p TT5-MBL,表达并纯化出有活性的重组MBL。成功分离纯化出有活性的血浆来源MBL蛋白。人工感染组绵羊在感染后均出现了咳嗽、食欲减退、流鼻涕、腹泻等支原体症状。绵羊肺炎支原体回收培养,多项支原体生化鉴定和支原体PCR鉴定结果表明人工感染组绵羊均成功感染了绵羊肺炎支原体,证明人工感染成功。MBL蛋白注射后,注射蛋白后均出现了不同程度的体温下降,食欲恢复,与实验对照组相比,注射蛋白的两组剖检的眼观变化和切片的病理变化可见症状有轻微的减轻。(2)蛋白注射后,血清中的IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、C3均在短期内有不同程度的升高,在蛋白注射14d后又逐渐降低,并且在不同时期均高于实验对照组。血清中C1表现为先降后升。说明注射蛋白后机体的细胞免疫和体液免疫功能均有所增强。注射MBL蛋白后患病机体MBL、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、C1和C3表达水平均有不同程度的升高,随后逐渐降低,说明随着病程的发展,炎症有所舒缓。(3)筛选出多多个免疫相关的mi RNA和信号通路。结论:(1)建立了绵羊MBL基因真核表达载体的构建方法。(2)MBL蛋白免疫治疗能短期内减轻绵羊支原体肺炎的临床症状和病理变化,增强机体的细胞免疫和体液免疫,提高机体的抗病能力,改善炎症状况。(3)利用高通量测序技术筛选出多个免疫相关的mi RNA和信号通路。