论文部分内容阅读
临床骨质疏松症作为临床常见的代谢性骨病变，患者骨质脆性增加以致其骨折风险提高，严重影响患者生活质量且增加社会医疗经济负担。因其病理机制复杂，虽然多种中西医预防及治疗措施已广泛应用，但仍是临床骨科一大难题和挑战。近年来，关于骨质疏松分子生物学研究进展如长链非编码RNA等，为疾病认知和治疗打下坚实基础。本研究据此提出了“长链非编码RNA-ANRIL调控PRC-CDKN2B机制”可能在骨质疏松病机及治疗中发挥重要作用这一假设，并设计实验证实，从而阐明骨质疏松机制并为其针对治疗开辟了新的思路，具有重要的临床指导意义。 1、长链非编码RNA-ANRIL结合PRC2调控CDKN2B甲基化对人BMSCs骨重塑相关基因蛋白调控效应探讨 2、长链非编码RNA-ANRIL对淫羊藿苷作用下人BMSCs成骨分化阶段性效应分析及依赖性探讨 3、ANRIL-PRC2-CDKN2B在骨质疏松症中表达分析及相关性价值探讨 实验目的1: 构建shRNA-ANRIL转染人BMSCs模型并初步探讨其生物学效应 实验目的2: 研究分析shANRIL及淫羊藿苷对人BMSCs成骨分化的效应特点 实验目的3: 分析临床骨质疏松患者骨样本中ANRIL、CDKN2B表达及相关性 实验方法1: 体外构建shRNA-ANRIL重组质粒并验证有效性，转染人BMSCs;BSP检测CDKN2B基因甲基化水平，RIP和CHIP技术分别检测PRC2复合体与ANRIL和CDKN2B的结合;分析BMSCs增殖、凋亡活性改变;qPCR和western blot检测基因及蛋白表达情况。 实验方法2: 取人BMSCs并进行诱导分化培养:首先验证ANRIL对人BMSCs分化的效应，分组为对照组和shANRIL组;检测淫羊藿苷作用机制，分组为对照组和淫羊藿苷组;最后将上述两分组方法进行列联分四组。检测内容为:CCK-8实验、茜素红染色等分析BMSCs增殖活性、分化程度改变;qPCR和western b1ot检测基因及蛋白表达情况;基因芯片技术筛选出对照组生长期细胞的差异性表达基因;BSP技术检测OPG和RNAKL启动子片段甲基化改变 实验方法3: 临床采集非绝经骨质疏松病人（SOP组）、绝经后骨质疏松病人（PMOP组）及对照组椎体松质骨样本，分析病例疾病信息后，采用qPCR、免疫组化和Western blot分析ANRIL-PRC2-CDKN2B、及骨质疏松相关基因和蛋白表达水平，统计学分析得出相关性结论。 实验结果1: 通过shRNA技术沉默ANRIL构建重组质粒，质粒测序证实插入片段碱基序列符合预设，qPCR显示shRNA沉默后ANRIL转录活性明显减低;shRNA沉默ANRIL后，BSP检测CDKN2B基因甲基化水平调低并筛选出去甲基化位点，RIP技术观察到ANRIL与PRC2复合体的结合减低，CHIP技术发现CDKN2B与PRC2复合体的结合增多;shANRIL干预后BMSCs细胞CCK-8吸收率减低提示增殖活性减弱，同时AnnexinⅤ流式阳性率增高提示其诱导凋亡;ANRIL沉默后，细胞周期因子E2F1、CDk4、CDk6基因、蛋白表达减少，CDKN2B及成骨性ALP、Runx2、Osterix、OPG、OCN、TGFβ1基因转录、蛋白表达增多，Smad2/3，MAPK JNK及ERK磷酸化程度减低。 实验结果2: shRNA-ANRIL作用于诱导成骨分化不同阶段的人BMSCs，细胞增殖活性仅于早期下降，中晚期恢复。shANRIL可促进ALP高峰出现，促进OPG基因表达，但于分化晚期抑制蛋白表达，促进OCN、Runx2、Osterix基因、蛋白表达，TGF-β1基因转录，中晚期促进蛋白表达，提高Smad2/3磷酸化比例，并减低MAPK ERK和JNK蛋白磷酸化比例。通过基因表达芯片研究shANRIL作用下对照生长期BMSCs的差异性表达基因，通过基因芯片筛选出人对照生长期BMSCs中CDKN2B作用结合的Macf1等靶基因9548个，可信度较好。通过KEGG通路富集注释分析得出MAPK信号通路等相关富集通路;通过GO功能性注释鉴别出信号结合等相关功能，并汇制基因功能网络分析图。BSP技术检测shANRIL作用后，OPG启动子位点1和5两处片段及RANKL启动子位点7存在去甲基化改变，表明ANRIL可能通过CDKN2B甲基化调控OPG和RNAKL启动子片段去甲基化，影响成骨破骨活动。 淫羊藿苷呈时间浓度特异性地促进BMSCs增殖，在BMSCs成骨分化过程早期提高ALP活性，FCM和茜素红染色结果显示淫羊藿苷促进钙离子细胞内沉积。RIP技术检测淫羊藿苷可抑制ANRIL与PRC2结合，淫羊藿苷可抑制ANRIL并提高CDKN2B表达，提高ALP、Runx2、Osterix、OPG、OCN、TGF-β1基因及蛋白表达，提高Smad2/3磷酸化比例，分化早、中期提高MAPK ERK和JNK蛋白磷酸化比例。淫羊藿苷促进BMSCs增殖而shRNA-ANRIL抑制细胞增殖，其机制与非ANRIL介导的E2F1、CDk4、CDk6转录因子调控有关。成骨分化方面，淫羊藿苷同shRNA-ANRIL效应相似，通过抑制ANRIL转录，从而上调CDKN2B基因表达，促进成骨性转录因子ALP、Runx2、OPG、OCN、TGF-β1蛋白表达，其通路机制可能与Smad2/3及MAPK ERK和JNK磷酸化调控有关，于不同时期呈时间特异性地提高BMSCs成骨分化活性。 使用shANRIL和淫羊藿苷同时干预成骨分化过程中的BMSCs后，出现了成骨标志性基因、蛋白表达及CDKN2B基因转录的协同性表达，表明淫羊藿苷通过ANRIL发挥BMSCs促分化效应。具体来说，ANRIL基因沉默后，淫羊藿苷的促进CDKN2B基因转录转录效应增强，但周期调控因子E2F1和CDk4表达减低，shANRIL促进淫羊藿苷的ALP分泌高峰提前，并促进其OPG、OCN、Runx2和Osterix基因、蛋白的表达增强效应，与此同时，TGF-β1及Smad2/3磷酸化也出现相似改变，提示其可能机制。 实验结果3: 临床采集共9例椎骨样本，对照组、SOP组和PMOP组均为3例。临床病例基本信息分析结果显示:PMOP组年龄高于对照组，而PMOP组和SOP组的BMD指数均低于对照组;骨标志物四项和骨五项检测中，仅有PMOP组的25-羟基维生素D和Ⅰ型胶原氨基端延长肽高于对照组，血清镁离子低于SOP组。总体结果显示纳入研究的病例具有代表性，适用于进行进一步的基因蛋白分析。qPCR基因表达分析结果可知，PMOP组和SOP组的ANRIL转录活性强于对照组，但PMOP组ANRIL转录表达低于SOP组，以上趋势同样存在于骨代谢性基因ALP、RANKL、RANK、AP-1、Scr及NF-κB p50的表达检测中。取骨组织行切片后Runx2、OPG和RANKL蛋白免疫组化染色，结果显示对照组的Runx2和OPG呈强阳性大范围分布，而RANKL弱阳性分布;SOP和PMOP组Runx2和OPG表达及分布程度减低，RANKL呈强阳性反应;PMOP组的OPG和RANKL表达分布均低于SOP组。Western blot检测结果中，PMOP组的ALP、RANKL、RANK、AP-1、Scr及NF-κB p50的蛋白表达同样低于SOP组。相关性统计分析结果表明，ANRIL转录水平同OPG转录活性呈负相关，而CKDN2B转录水平与OPG翻译活性呈正相关;ANRIL转录水平同ALP、RANK、RANKL、Scr、NF-κB p50的基因转录、蛋白表达水平均呈显著性正相关性，与AP-1蛋白表达水平亦存在正相关性。 实验结论1: 体外构建shANRIL重组质粒，效果满意，成功转染人BMSCs;ANRIL以“ANRIL结合PRC2抑制CDKN2B甲基化”方式发挥调控作用;ANRIL可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡;ANRIL上调细胞周期因子表达，抑制细胞成骨分化因子表达及激活Smad2/3、MAPK ERK/JNK细胞通路;CDKN2B调控多种靶基因，参与细胞的增值分化相关等功能。 实验结论2: 淫羊藿苷通过调控ANRIL-CDKN2B方式呈时间特异性地促进人BMSCs成骨分化，促进成骨相关因子ALP、Runx2、OPG、OCN的基因及蛋白表达，其通路机制可能与TGF-β1-Smad2/3及MAPK ERK和JNK磷酸化调控有关。 实验结论3: 临床骨质疏松患者的ANRIL转录活性升高且绝经抑制其表其达，ANRIL RNA基因转录可与OPG、ALP、RANK、RANKL、AP-1、Scr、NF-κB p50转录等因子具有显著性相关性，表明ANRIL在临床骨质疏松骨质病机中具有调控意义，具有进一步了解骨质疏松机制和研发药物等潜力。