论文部分内容阅读
黄瓜是世界上普遍栽培的重要园艺作物之一，是我国设施栽培的第一大园艺作物，在我国蔬菜生产和消费中占有举足轻重的地位，然而我国设施生产中普遍存在的低温问题严重影响了黄瓜的产量和品质。转录因子在植物抗逆过程中起到重要的开关作用，WRKY转录因子家族在植物抗逆性反应中扮演重要的角色，因此在黄瓜基因组测序完成的有利条件下，以黄瓜为研究材料，明确WRKY转录因子在低温逆境中所起的作用及分子调控机制的形成，有助于我们更好的理解低温信号的转导及调控，为解决设施瓜类生产中存在的问题提供理论依据，具有重要的应用价值。我们通过生物信息学方法找到了黄瓜中的WRKY家族因子，预测低温相关的WRKY，在生理、生化和分子生物学水平重点研究黄瓜CsWRKY46和CsWRKY21在低温调控中的功能及其在冷信号途径中的作用，所得主要结论如下：（1）从黄瓜中克隆了CsWRKY46和CsWRKY21两个WRKY转录因子，并对其进行生物信息学分析。CsWRKY46开放读码框为786bp，编码262个氨基酸，蛋白分子量约28.6kDa，包含2个内含子和3个外显子，属于WRKY转录因子第II类家族，与拟南芥AtWRKY71同源。CsWRKY21开放读码框948bp，编码316个氨基酸，蛋白分子量约34.5kDa，包含4个内含子和5个外显子，也属于WRKY转录因子第II类家族，与拟南芥AtWRKY40高度同源。（2）CsWRKY46和CsWRKY21受低温和ABA诱导表达上调。实时荧光定量PCR分析CsWRKY46和CsWRKY21基因均响应低温胁迫和外源ABA，且被诱导上调表达。RT-PCR结果显示CsWRKY46和CsWRKY21基因在黄瓜10个组织中均有表达，且CsWRKY21在花中表达量较高。（3）CsWRKY46和CsWRKY21两个蛋白均定位于细胞核中。成功构建CsWRKY46和CsWRKY21与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达载体，通过检测GFP融合蛋白在拟南芥原生质体中的瞬时表达，揭示CsWRKY46和CsWRKY21两个蛋白均定位于细胞核中。（4）构建CsWRKY46和CsWRKY21过表达载体和干扰表达载体，将过表达载体成功转化拟南芥。CsWRKY46过表达转基因植株抗冻表型明显，是冷信号通路的正调节子；CsWRKY21过表达转基因植株的抗冷性也增强。冰冻处理后CsWRKY46过表达转基因植株与野生型相比表现出抗冻表型，存活率提高30.67%。低温处理后，与野生型相比，转基因过表达植株抗逆相关生理指标EC，MDA和脯氨酸均呈显著差异，表明CsWRKY46过表达转基因植株较野生型抗冷性增强；转基因过表达CsWRKY46增强了COR47，RD29A，KIN1和ABI5等冷胁迫和ABA相关基因的表达。冰冻处理后CsWRKY21过表达转基因植株与野生型相比表现稍有抗冻，存活率虽有提高，但并未达显著，低温处理后抗逆相关生理指标EC，MDA和脯氨酸的变化显著，均表明CsWRKY21过表达转基因植株较野生型抗冷性增强；转基因过表达CsWRKY21增强了COR47，RD29A，KIN1，CBF1，CBF2和CBF3等冷信号通路基因的表达，推测其可能响应依赖于CBF的冷信号途径。（5）过表达转基因CsWRKY46对ABA表现超敏。与野生型相比，外源ABA处理对过表达转基因CsWRKY46的萌发抑制效果明显，但对幼苗的生长影响微弱，进一步说明了CsWRKY46可能通过ABA依赖途径正调控冷信号通路。（6）在大肠杆菌中成功诱导表达了CsWRKY46和CsWRKY21蛋白，为进一步在蛋白水平研究基因功能奠定基础。综上所述，本研究明确了2个黄瓜WRKY转录因子CsWRKY46和CsWRKY21在低温逆境胁迫抗性中的作用。黄瓜CsWRKY46作为正调控因子参与了植物对低温胁迫应答反应，并可能通过ABA依赖途径调控低温信号通路；CsWRKY21也是低温胁迫的正调节子。为进一步解析园艺作物抗逆的分子机制以及相关转录因子在蔬菜抗逆中的应用奠定了重要基础。