论文部分内容阅读
目的：心肌梗死是全球范围内主要致死原因之一,再灌注疗法能够有效挽救缺血心肌,但缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)损伤诱导的心肌顿抑、再灌注心律失常、微血管功能失调以及无复流现象(no-reflow, NR)的出现明显削弱了再灌注疗法的心肌获益。中性粒细胞胞外核酸网(neutrophil extracellular traps, NETs)是中性粒细胞在病原体或细胞因子等刺激下,借助于活性氧类物质的辅助,释放的由核染色质、组蛋白以及胞内抗菌蛋白混合而成的网状结构。研究显示,NETs可通过其网状结构捕获并杀灭入侵的微生物,是中性粒细胞抵抗病原体入侵、限制其体内播散的新途径。新近研究显示在无菌性炎症中NETs的产生与血栓形成密切相关。本研究利用缺血再灌注损伤诱导解剖无复流的动物模型,探讨NETs是否存在于大鼠的缺血再灌注心肌,并且观察清除NETs及NETs相关血栓是否能够提高缺血再灌注后的心脏复流、挽救缺血心肌并且最终改善心肌缺血引起的心室重塑。方法：6周龄雄性Wistar大鼠适应性喂养1周后,随机分组。根据干预药物脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease I, DNase)和重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA)使用方式的不同分为I/R Control组(注射生理盐水)、DNase组(注射DNase)、rt-PA组(注射rt-PA)、DNase+rt-PA组(注射DNase和rt-PA)、Sham Control组(注射生理盐水)。各组大鼠开胸结扎冠状动脉左前降支(Sham组只穿线不结扎血管)45min后再灌注3h。于再灌注开始前5min静脉注射干预药物。通过组蛋白2B (histone2B,H2B)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)以及脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)的三色免疫荧光激光共聚焦显微成像检测心肌组织是否存在NETs。通过氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)和伊文斯蓝(Evans blue)双重染色评估干预药物对于大鼠心肌梗死面积的影响。通过硫磺素S和伊文斯蓝双重染色评估干预药物对于大鼠心肌无复流面积的影响。长期实验在保留短期实验手术组的基础上,将假手术组增加为Sham Control组、Sham DNase组、Sham rt-PA组、Sham DNase+rt-PA组四组。各组大鼠开胸结扎冠状动脉左前降支(Sham组只穿线不结扎血管)45min后再灌注。于再灌注开始前5min静脉注射干预药物。术后45天时应用无创心脏二维超声检查和有创血流动力学检测评估大鼠心脏功能及血流动力学改变情况。心脏取材后利用马松三色染色(Masson trichrome staining)分析左室梗死区游离壁厚度(left ventricular free wall thickness, LVWT).室间隔厚度(septum thickness, SPT),并计算心脏膨展指数(index of expansion, IE)。应用麦胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)染色分析心肌细胞横断面积(myocardial cross-sectional area, MCSA)。结果：在缺血45min再灌注3h的大鼠心肌内存在H2B、MPO以及DNA三种物质的相互融合共表达,且无完整的细胞形态,提示NETs存在于缺血心肌组织中。短期实验评估心肌梗死面积和解剖无复流面积,结果显示：各手术组缺血范围一致。与I/R Control组相比,DNase+rt-PA组大鼠心梗面积比例(infarct area/area at risk, IA/AAR)明显降低(P<0.001),同时该组大鼠无复流面积比例(no reflow area/area at risk, NR/AAR)明显降低(P=0.033)。长期实验评估心脏结构和功能,结果显示：与I/R Control组相比,DNase+rt-PA组大鼠心脏射血分数(ejection fraction, EF)和短轴缩短率(fractional shortening, FS)明显升高(P=0.024,P<0.001),收缩期和舒张期左室内径(LVinternal diameter at end-systole/LV internal diameter at end-diastole, LVIDs/LVIDd)明显降低(P<0.001,P<0.001),左室收缩末期容积和舒张末期容积(end-systolic volume/end-diastolic volume, ESV/EDV)明显降低(P=0.002,P=0.002)。血流动力学结果统计显示,DNase+rt-PA组大鼠左心室压力最大上升速度(maximal slope of systolic pressure increment,+dP/dtmsx)和最大下降速度(maximal slope of diastolic pressure increment,-dP/dtmin)较I/R Control组明显升高(P=0.036,P=0.015),左室舒张末期压力(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP)明显降低(P=0.019),左室收缩末期压力(left ventricular end systolic pressure, LVSP)存在升高趋势,但无统计学差异(P=0.078)。病理学染色检测心室重塑显示,与I/R Control组相比,DNase+rt-PA组大鼠LVWT明显增大(P<0.001),IE明显增大(P=0.006), MCSA明显降低(P=0.034)。结论：本研究首次证实在大鼠I/R心肌内存在NETs,联合DNase和rt-PA干预可降低I/R后心肌梗死面积,提高心肌灌注水平,改善缺血后心室重塑。