论文部分内容阅读
大多数芽孢杆菌能够产生脂肽类物质,通常包括iturin、fengycin、surfactin家族等类的脂肽。此三大家族的脂肽具有抗植物病原真菌的能力。我们发现了一种协同增效因子,至少能和iturin,fengycin类脂肽之间有着协同增效的抗植物病原真菌的作用。基于这样一种作用,设计了一个新的协同增效筛选模型,用于拮抗植物病原真菌产抗菌肽目标菌株的筛选,并且对目标菌株的脂肽类产物进行了相关的研究。主要结果如下:
(1)从100多株海洋芽孢菌中以黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)等为靶菌,采用平板对峙法筛到了可以进入复筛的13株芽孢菌。将这13株菌用无机盐培养基发酵,分别取发酵液和粗脂肽用上述的筛选模型复筛,发现代号为9601,B0621A的两株菌抗菌作用很好。考虑粗脂肽的产率,9601为15mg/L,而B0621A为526mg/L,结合粗脂肽的RP-HPLC图谱,发现9601产物较单一,而B0621A含有iturin,fengycin,surfactin三大类型的脂肽。故选择B0621A为目标菌株,进行进一步的研究。
(2)B0621A菌株分离自中国南海涠洲岛珊瑚礁海域的合浦珠母贝(Pinctadamartensii)的外状膜,经形态学特征、生理生化特性、16SrDNA序列进化树将该菌鉴定为摩加夫芽孢菌(Bacillusmojavensis)(Genbank登录号为JN585825)。
(3)参考了相关的文献,进行了发酵培养基的探索和优化,并确定了发酵培养基为蔗糖2.0%,NH4NO30.2%,KH2PO40.3%,Na2HPO41.0%,MgSO4·7H2O0.02%,酵母提取物0.02%,CaCl20.7μg,MnSO4·4H2O1μg,pH7.0-7.2.。经摇瓶小试之后,大瓶发酵(接种量为3%左右,装液量为50%),共发酵24L。酸沉淀后得到粗脂肽15.51g,产率为646.25mg/L。粗脂肽经薄层快速柱色谱、RP-HPLC分离纯化之后得到了14个脂肽类化合物。
(4)采用了一系列的光谱学,质谱和化学降解衍生反应,最终确定了这些化合物的结构。其中化合物1,12,13,14的脂肪链末端结构不同,分别为anteiso-,iso-,iso-,anteiso-;环状氨基酸组成为L-Asn1,D-Tyr2,D-Asn3,L-Gln4,L-Pro5,D-Asn6,L-Asn7,是一类新型的iturin类脂肽,将之命名为mojavensin(摩加夫素)。化合物2和3经microQ-TOF2和1DNMR鉴定为iso-C16fengycinB(结构式为C75H115N11O20)和anteiso-C17fengycinB(结构式为C76H117N11O20);经1DNMR和HRESIMS,化合物4-11这8个化合物分别鉴定为surfactin家族的已知同系物。
(5)在浓度为2mg/mL时,化合物1有微弱的抗菌作用;化合物2和3具有浓度依赖性的抗菌作用,对包括串珠镰刀菌(Fusariumverticillioides)(MIC为0.250mg/mL)等20株植物病原真菌具有良好的抗性。这三个化合物对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus),人白血病粒细胞(humanleukemia(HL-60)cellline)具有微弱的作用,但对白色念珠菌(Candidaalbicans)没有作用。