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辣椒疫病是在世界范围内普遍发生的一种毁灭性病害,能侵染多种茄科及葫芦科植物。最早在1922年,Leon Leonian记载了发生在墨西哥辣椒疫病,确定其病原为Phytophthora capsici.病原物的成功侵染必须克服寄主的防卫系统,进而获取养分进行繁殖扩大侵染。卵菌病原物能够分泌效应蛋白,引起寄主生理变化,破坏寄主防御系统。NPP(Necrosis-inducing Phytophthora Protein),也被称为Nep-1 like proteins是一种典型的效应蛋白。许多真菌细菌及卵菌都可以产生诱导坏死蛋白,特别是卵菌中的疫霉属基因组存在大量的诱导坏死基因。植物受NPP处理表现为乙烯释放,MAP激酶活化,植保素合成,PR基因诱导表达,胞质Ca2+释放等防御反应。NPP蛋白能够诱导多种双子叶植物产生过敏反应。NPP蛋白可能在病原微生物中作为毒蛋白,而在一些腐生生物里具备非毒性功能。但是目前对NPP蛋白功能尚不清楚,本研究主要对辣椒疫霉诱导坏死蛋白基因家族功能进行研究,探索其在疫霉侵染过程作用机制。本研究对辣椒疫霉菌株SD33内NPP基因家族的致病遗传机制及其功能进行了分析。具体内容如下:(1)对辣椒疫霉高致病性菌株SD33内NPP蛋白基因克隆并进行生物信息学分析。首先对辣椒疫霉基因组序列进行生物信息学分析,特别分析了基因组内NPP基因家族信息。以高致病辣椒疫霉菌株SD33为材料,利用同源序列法克隆了该菌株内18个NPP基因并进行BLAST分析;在利用DNAman软件对克隆的序列进行比对,发现辣椒疫霉的NPP蛋白基因序列长度都在400– 1000 bp,并且都有严格保守的‘GHRHDWE’基序,以及C-端相对保守序列‘QDLIMWDQ’.(2)分析了18个NPP基因在菌体内的表达模式并进行系统进化分析。根据18个基因序列,设计特异引物借助RT-PCR分析了菌丝生长阶段基因家族不同基因的表达模式。结果发现有12个基因在菌丝生长阶段具有活性;同时下载不同物种的同源基因借助PAUP* 4.0软件进行了系统进化分析,结果显示所有来自卵菌的NPP基因都能聚成一支,而细菌和真菌的NPP基因却不能严格分支,说明NPP基因是卵菌基因组特有的标志,适合用于卵菌进化分析。(3)辣椒疫霉NPP基因在植物体内的功能分析。选择了12个基因为研究对象,分别构建了PVX表达载体,然后转化农杆菌进行瞬时表达。利用农杆菌侵染法接种烟草和辣椒幼苗。记录每个基因表达后所引起两种植物症状变化。结果显示辣椒和烟草的症状不同,并且各个基因成员在同一种植物上表达后的症状也是大相径庭;其中接种烟草的叶片大多出现坏死,黄化症状,个别基因接种没有引起植物防卫反应;而接种的辣椒叶片除了产生上述症状外,个别基因(Pcnpp7和Pcnpp8)的表达还出现了皱缩和卷曲症状。这说明了NPP家族成员基因功能的多样性,辣椒疫霉NPP基因可能还具备其它一些新的功能。(4)辣椒疫霉Pcnpp1潜在活性位点基因体外突变及其突变体在烟草及辣椒中的瞬时表达。根据已报道的同源NPP蛋白结构,预测该基因可能有4个潜在活性位点(D112, H120, D123, E125),利用OverLap PCR将4个活性位点分别进行定点突变(D112A, H120A, D123A, E125A )以及4个活性位点同时突变(112/120/123/125A)。并设计引物为这5个突变体分别构建PVX载体(PGR106),并利用冻融法转化农杆菌GV3101。然后接种烟草辣椒叶片,发现突变体都不能引起叶片坏死或者黄化。说明该基因所选择的4个氨基酸是该蛋白的活性位点,该蛋白可能具备酶活性,是一类具有酶活性的效应蛋白,但是具体底物未知。(5)辣椒疫霉NPP基因在病原寄主互作过程中表达模式分析。用游动孢子悬浮液接种离体辣椒叶片,在接种后1d, 3d, 5d, 7d取样然后提取发病叶片总RNA。反转录后用荧光定量PCR分析了12个候选基因在疫霉侵染过程中的表达模式。实验结果显示表达模式分两种情况。即Pcnpp1, Pcnpp2, Pcnpp6, Pcnpp9和Pcnpp10的表达模式基本一致,其表达量在侵染初期成上升趋势,都在第3 d的表达量最高;而Pcnpp3, Pcnpp5, Pcnpp7, Pcnpp8, Pcnpp13, Pcnpp14和Pcnpp15表达量在整个侵染过程成上升趋势,在侵染后期达到峰值。这说明NPP蛋白在病原侵染的整个阶段都表达,病原与植物防御系统间的反应不仅局限于侵染初期,还可能持续整个侵染过程。辣椒疫霉诱导坏死基因家族的成员分别在不同的侵染时期参与克服植物防御反应,在致病过程中起到重要作用。(6)借助PEG介导的原生质体转化方法,得到了7个沉默突变体菌株,实现了10个候选基因的沉默。根据各基因序列设计基因特异性引物及载体pHAM34酶切位点,构建了12个候选基因的沉默表达载体。将重组质粒及标记质粒pHspNpt转入辣椒疫霉SD33原生质体,利用抗生素G418筛选转化子。得到的转化子在V8培养基上生长并记录生物性状,包括菌丝生长速率、菌丝形态、游动孢子产率等等。同时提取转化子菌体总RNA,反转录后,荧光定量PCR分析各候选基因在各转化子内的沉默效率。结果显示,7个转化子中除了Pcnpp6和Pcnpp8外,其余10个基因的沉默效率都在80%以上,并且出现了多个基因在同一个转化子内共沉默的现象,这可能是相关基因同源性较高,发生了染色体异染色质化的原因。此外基因沉默并没有引起疫霉菌株生物性状的变化。(7)对转化子的致病性进行了检测,利用游动孢子接种方法处理辣椒幼苗叶片,以野生型菌株为对照,记录叶片发病情况及病斑大小。分析结果发现沉默突变体的致病力明显降低,表现为症状产生时间延缓并且病斑面积明显变小。说明NPP基因沉默导致菌株致病力降低,NPP在病原侵染过程中起到重要作用。综合所有实验结果,我们认为辣椒疫霉诱导坏死基因是以基因家族形式存在的,在寄主病原互作过程中扮演着重要角色。NPP基因是卵菌,特别是疫霉菌的一个典型特征。辣椒疫霉诱导坏死基因不仅能使植物产生常见的坏死,萎蔫等症状,还会引起寄主叶片皱缩坏死。基因家族各成员的功能存在差异,即使同源性很高的基因基因之间也可能存在显著的功能差异,对基因家族功能的研究不能局限于个别基因功能的分析。NPP蛋白可能是一种具备酶活性的效应蛋白,或者可能是一种毒蛋白,但是具体作用底物还是未知的。NPP基因沉默不会引起菌株表型变化但会导致转化子致病力明显降低。此外很难实现基因家族单一成员或者全部成员基因沉默,但是并不影响对该类基因功能的分析。将该家族10个基因进行稳定沉默,进行致病性测定分析发现该家族部分成员沉默会导致菌株致病性明显降低。利用稳定基因沉默对于基因家族成员功能的研究是个很好的选择。