论文部分内容阅读
本研究以Mureidomycin和谷氏菌素两种不同类型的核苷类抗生素为研究对象，深入研究Mureidomycin隐性基因簇的激活以及谷氏菌素生物合成中关键基因的功能，为隐性基因簇激活、组合生物合成获得新型抗生素提供新思路。基因组挖掘发现玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）基因组中包含一个与Napsamycin生物合成基因簇类似的基因簇，但该基因簇在玫瑰孢链霉菌中不能正常表达，也未能检测到其代谢产物。本研究通过引入Sansanmycin基因簇中的正调控基因ssaA，将其高表达后有效激活了该基因簇，激活产物对铜绿假单胞菌具有明显的抑制作用。通过质谱和核磁共振分析鉴定了8个乙酰化的Mureidomycin衍生物，其中7个为新化合物，通过对各组分间的构效关系研究发现核心骨架上关键氨基酸的差异对其活性有明显的影响。谷氏菌素核苷和肽基部分的缩合机制是这类抗生素生物合成中的研究重点和难点，为了揭示其缩合反应的分子机制，我们首先构建了gouJ和gouK的缺失突变株△gouJ和△gouK。HPLC分析发现这两个突变株均丧失了产生谷氏菌素的能力，但积累了不同的谷氏菌素中间产物。质谱和NMR分析鉴定了△gouJ中积累产物为化合物3a/3b，△gouK积累了4-氨基-CGA。其中4-氨基-CGA为谷氏菌素的核苷骨架，而化合物3a/3b为4-氨基-CGA和丝氨酸的缩合产物。这些结果初步揭示GouK参与丝氨酸和4-氨基-CGA合成中间产物化合物3a/3b，GouJ则参与化合物3a/3b和肌氨酸缩合形成云南霉素，后者通过其他酶的作用形成谷氏菌素。本研究为谷氏菌素生物合成途径的阐明奠定了坚实的基础。此外，通过增加谷氏菌素生物合成基因簇的拷贝数以及关键结构基因的启动子替换，获得了谷氏菌素高产工程菌株。通过添加不同底物（丝氨酸、胞嘧啶和甘氨酸）优化发酵培养基，可进一步提高谷氏菌素的产量。本研究策略可为其它重要抗生素的产量提高提供理论依据和技术指导。