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目的：猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)是一种引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus-associated disease，PCVAD)的主要致病因子。但是，PCV2致病的分子机制到目前仍未阐明。在对PCV2基因组研究中，已有6个开放阅读框(ORFs)得到了初步验证，其中ORF1编码Rep蛋白与复制功能相关，ORF2编码Cap蛋白是病毒外壳蛋白，ORF3蛋白参与细胞凋亡，ORF4蛋白参与细胞凋亡的抑制，ORF5蛋白参与细胞内质网的应激，ORF6蛋白可增强病毒的复制。本实验室之前的研究中通过RT-PCR和快速扩增cDNA末端技术发现了一种新转录物ORF3，但是目前对其生物功能尚不清楚。本研究通过ORF3蛋白的表达和制备多克隆抗体检测了其在细胞内的表达，构建了PCV2ORF3表达缺失病毒，为进一步研究其在病毒复制、转录和致病性中的作用奠定了基础。 方法：首先在实验室已有研究的基础上，按照毕赤酵母表达系统密码子优化的ORF3序列合成GST-ORF3并连接至pPIC9k质粒，线性化后电转入GS115感受态细胞中，筛选表型后诱导表达目的蛋白GST-ORF3。以pPIC9k-ORF3-GST重组质粒为模板扩增GST-ORF3片段，pGEX-4T-1质粒和PCR产物双酶切后连接构建重组表达载体pGEX-4T-ORF3，转化大肠杆菌诱导表达GST-ORF3蛋白;纯化表达蛋白后制各兔多克隆抗体。对PCV2全序列分析后选择突变位点，通过改变起始和终止密码子使ORF3的蛋白翻译过程无法正常进行，构建自环化突变型质粒并转染PK15细胞回收突变病毒，通过Western blot和IFA检测病毒感染稳定性和相关蛋白表达。 结果：(1)成功将pPIC9k-GST-ORF3线性化后电转入GS115酵母细胞并对筛选的Mut+表型的重组酵母诱导表达目的蛋白，但未检测到目的蛋白的产生;(2)成功构建原核表达载体pGEX-4T-ORF3，通过测序和相应引物PCR鉴定正确后在大肠杆菌BL21中成功诱导表达了GST-ORF3蛋白，通过SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达后割胶纯化目的蛋白;(3)将纯化的蛋白免疫新西兰兔后获得抗GST-ORF3抗血清，通过Western blot对GST-ORF3进行检测证明其具有反应特异性;(4)成功构建了在PK15细胞中可连续传代并具备感染能力的重组野生型和突变型病毒;(5)对感染野生型病毒的PK15细胞进行免疫荧光鉴定，观察到ORF3蛋白在PK15细胞中存在，表明ORF3基因可以在PK15细胞中表达。