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昆虫细胞作为重组病毒的表达载体能成功高效地表达外源基因,生产具有重要医用价值、具备天然活性的生物工程制品,因此昆虫细胞培养倍受青睐。目前,可通过转基因的方法改良现有细胞,从而获得高产昆虫杆状病毒和外源蛋白的昆虫细胞系。
本研究是利用构建的转P35基因工程细胞系,G418筛选、经单细胞克隆,共得到转P35基因细胞克隆株45株,又通过细胞传代选出克隆株37株。这37株细胞系分别经PBS、AMD处理,病毒滴度和多角体产量比较筛选出10个克隆株。10株细胞分别接种昆虫病毒TnGV、TnNPV、MsNPV、PiNPV、AcMNPV,其中仅Tn5B-1-8对所测的所有NPV病毒敏感,即命名为Tn5B-P35(简写为Tn5B-35)。
Tn5B-35细胞形态主要为纺锤形和圆形,贴壁生长,大小为18.2×41.0μm。增殖很快,群体倍增时间为22.27h,最大生长密度可达2.14×106cells/mL。对AcMNPV病毒感染率达95﹪,多角体产量平均为115OBs/cell。Tn5B-35有较强的营养抗逆性,细胞在无营养的PBS盐缓冲液中1d以后,Tn5B-35细胞有86﹪存活,比野生型Tn5B1-4细胞高出24﹪,第5d时,Tn5B1-4细胞全部死亡,Tn5B-35第5d仍然有42﹪存活细胞。用含不同浓度放线菌素D的培养基处理Tn5B-35细胞1h,当放线菌素D浓度为0.31,0.62,1.25和2.5μg/mL时,Tn5B-35细胞的存活率分别比Tn5B1-4高出37﹪,55﹪,65﹪和68﹪,当浓度高达5μg/mL时,Tn5B1-4细胞全部死亡而Tn5B-35细胞仍有52﹪的生存率。说明此细胞具有抗凋亡的特性。
昆虫病毒AcMNPV在Tn5B-35细胞中离体传代25次,病毒未出现传代效应,其病毒滴度、多角体形态及产量、杀虫毒力均无明显变化。Tn5B-35细胞是昆虫杆状病毒离体复制的优良细胞系。
我们对Tn5B-35细胞的基因组进行PCR鉴定,结果表明转化细胞Tn5B-35含有P35基因,即重组质粒pIZ/V5-His/p35已经整合到细胞的染色体上。