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化学农药的大规模使用在减小农业损失的同时，已造成了严重的环境、生态及食品安全等问题。因此，环境友好的害虫控制技术，例如微生物杀虫剂的研制与应用，正成为国内外研究热点之一。作为微生物杀虫剂中不可或缺的一大类，真菌杀虫剂在农林害虫持续控制中发挥着重要的作用。不同于昆虫病原细菌和病毒，杀虫真菌通过昆虫体壁进行主动入侵，对蚜虫、粉虱等刺吸式口器的害虫具有独特的防治优势。 罗伯茨绿僵菌和球孢白僵菌作为代表性的杀虫真菌，基础研究及应用研究均取得了良好的进展。然而，同其他微生物杀虫剂类似，真菌杀虫剂的应用同样存在杀虫速率慢、环境适应性不强以及防治效果不稳定等缺点，一定程度上制约了真菌杀虫剂的广泛应用。因此，深入研究杀虫真菌的分子致病机理，针对性地对杀虫真菌进行遗传改造，有利于提高杀虫真菌的应用效率。 本研究论文分为三部分:第一部分是通过在球孢白僵菌中表达外源酪氨酸酶基因Tyr，获得了高效抗紫外的工程菌株;第二、三部分分别通过基因敲除等方法，研究了Mrhex1和Mrskn7两个基因对于罗伯茨绿僵菌的生长以及致病性的影响。主要结果如下: 1.利用酪氨酸酶对酪氨酸、多巴等底物的氧化反应来合成黑色素(melanin)及其类似物，以期通过遗传改造获得高效抗紫外菌株，从而提高球孢白僵菌对紫外线的抵抗能力。通过克隆烟曲霉（Aspergillus fumigatus）酪氨酸酶基因Tyr，并利用农杆菌介导的真菌转化方法，成功地在球孢白僵菌中表达Tyr。结果表明，在球孢白僵菌中表达酪氨酸酶，获得的转化子在固体平板上产生的孢子颜色较野生型偏黄;通过提取孢子色素并经HPLC分析，发现转化子有黑色素类似物的产生。抗紫外试验表明，转化子的孢子经过不同紫外强度照射后，萌发率明显高于野生型菌株。生物测定表明，转化子的杀虫毒力较野生型也有一定程度的提高。 2.丝状真菌伏鲁宁体(Woronin bodies)作为细胞间隔开关，可以调节相邻细胞间细胞质的流动，而且当菌丝体受伤后，它还可以迅速与菌丝隔膜结合形成孔塞以防止细胞内含物的流失。通过克隆罗伯茨绿僵菌伏鲁宁体主要组成蛋白之一的Hex1p编码基因Mrhex1，利用基因敲除的方法研究其对于罗伯茨绿僵菌的生长以及致病性的影响。结果表明，与野生型和回补转化子相比，Mrhex1基因敲除突变子菌丝隔膜两侧伏鲁宁体消失，生长速率明显减慢，产孢量显著下降，附着胞形成存在缺陷。生物测定结果表明突变子的杀虫毒力显著下降。另外，由于hex1在蛹虫草子实体阶段高表达，因此将罗伯茨绿僵菌Mrhex1基因在蛹虫草中过表达，发现转化子的孢子萌发率明显提高，子实体中虫草素含量显著增加。以上研究结果表明，Mrhex1基因可能参与调控罗伯茨绿僵菌和蛹虫草的基础生长以及次级代谢。 3.罗伯茨绿僵菌中存在类似酵母双组份系统的反应调节蛋白Skn7，命名为Mrskn7，利用基因敲除等方法研究该基因在罗伯茨绿僵菌中的作用与功能。结果表明，Mrskn7基因敲除突变子在PDA培养基上丧失了产孢能力，菌丝生长到后期出现自溶现象;在盐胁迫条件下，突变子恢复部分产孢能力，但孢子的杀虫毒力显著下降;基因表达分析结果表明，细胞自溶信号标志基因NagA、几丁质酶和蛋白酶基因均显著上调;另一方面，突变子细胞壁合成相关基因的表达出现明显下调，进一步细胞壁染色发现突变子的细胞壁成分出现严重缺陷。基于上述实验结果，我们认为Mrskn7作为一类转录因子，潜在参与并影响细胞壁合成、菌体自溶以及产孢机制等多条通路的调控。 总之，本论文分别以球孢白僵菌和罗伯茨绿僵菌为对象，开展了遗传改造及不同基因的功能研究，研究成果对于探索提高真菌杀虫剂的环境应用稳定性，以及理解杀虫真菌发育与致病的分子机理起到了良好的促进作用。