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分子标记是以DNA分子碱基的变异作基础,所揭示的多态性直接反映基因组DNA之间差异的遗传标记。与其他标记相比较,分子标记具有显著的优点,已基本取代旧的遗传标记方法。微卫星标记因具有丰富的多态性、共显性、侧翼序列保守性等优点已成为主流的分子标记法。SSR标记引物的开发需建立在物种微卫星位点已知的基础上,因此进行微卫星标记的开发大多需建立基因组文库,有时利用微卫星标记引物的通用性来开发相近物种的微卫星引物也是可行的。利用物种SSR位点的多态性所开发的分子标记大大简化了标记开发的难度,并能提供大量的多态性信息。
薇菜茎色鲜味美,营养丰富,含人体必需的多种氨基酸、维生素及微量元素。薇菜制成的薇菜干具有重要的经济价值,是我国出口创汇的重要蔬菜之一。但薇菜的利用仍以野生资源为主要方式,又因国际市场该产品的供不应求,导致人们对薇菜过度采收,使其品质逐年下降,野生资源逐步枯竭。因此本文用SSR分子标记的方法在基因组水平上对薇菜进行了研究,设计了多对SSR引物,丰富了薇菜DNA序列的数据,填补了薇菜微卫星标记研究领域的空白,为今后人工优良薇菜品种的筛选培育、以及更深入的基础理论研究奠定分子遗传学基础,有利于薇菜资源的可持续合理利用。
本文采用FIASCO方法构建了薇菜的基因组富集文库,并设计引物进行了PCR筛选。实验结果如下:
(1)用FIASCO方法构建的薇菜基因组文库中有上千个克隆,从中随机挑选67个阳性克隆进行测序,除未有序列结果外的43个序列中有40个含有重复次数较多的微卫星序列。依据这些重复序列设计了19对引物,经筛选有11个有较好的扩增。
(2)在实验过程中,通过对多个探针和多种实验条件的比较,改进了FIASCO富集的方法,并加入了验证步骤,使最后的阳性克隆率有着较高的结果。
(3)对11对微卫星引物的扩增条件做了优化,分析了每对引物扩增的最佳体系及退火温度。
综上所述,本研究开发并验证了薇菜的11对微卫星标记,可以用来对薇菜的多态性进行研究,为构建其遗传连锁图谱并进行遗传背景分析、基因组结构分析、标记辅助育种等提供了基础,有利于薇菜的可持续合理利用。