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目的:1.合成两类不同粒径的新型靶向纳米光敏剂scFv-Z@FRT及HANP/Ce6并进行表征,分别评估其稳定性、水溶性及ROS生成情况,为二者的进一步研究与应用提供依据。2.评价scFv-Z@FRT与不同肿瘤组织的结合能力。探讨scFv-Z@FRT介导的PDT在裸鼠双侧4T1肿瘤模型中CAF及胶原的清除情况,评估PDT后不同粒径的纳米颗粒在肿瘤中的累积和渗透效应。3.探讨HANP/Ce6的细胞毒性、靶向性及生物分布情况。评价HANP/Ce6介导的PDT对HT29荷瘤鼠的疗效,并探讨18F-FDG PET在其疗效评估中的应用价值。方法:1.采用聚合酶链反应（PCR）从cDNA扩增FRT DNA区段,将其连接到pRSF质粒上,而后转化到大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞中。将筛选得到的pRSF/FRT质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,诱导铁蛋白产生后进行纯化。为获得抗FAP scFv,我们将相应DNA编码序列片段插入pOPE101质粒中,并转化到具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌JM109中。将PelB信号肽序列插入scFv的N端,诱导抗FAP scFv产生后进行纯化。我们将铁蛋白溶液的pH降低至2.0,以破坏相邻铁蛋白亚基之间的相互作用,再将ZnF16Pc加入DMSO中并添加到溶液中,然后缓慢调节pH至中性以诱导纳米笼重构,而后经纯化得到Z@FRT。使用二（磺基琥珀酰亚胺）辛二酸（BS3）作为交联剂将抗FAP scFv偶联到Z@FRT上,纯化粗产物后获得scFv-Z@FRT。使用动态光散射测量FRT、Z@FRT及scFv-Z@FRT的粒径分布。将终产物scFv-Z@FRT置于PBS中持续7日以观察溶解情况及稳定性。使用671 nm激光以0.1 W/cm2分别于1分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟时照射Z@FRT和游离ZnF16Pc溶液,记录525 nm荧光以比较二者的单线态氧的生成情况。2.使用IRDye800CW（ex/em=780/800 nm）标记scFv-Z@FRT,之后将scFv-Z@FRT与原发性4T1肿瘤、LL/2肝、肺转移瘤的组织切片共同孵育,以验证scFv-Z@FRT与不同肿瘤的结合能力。为了验证其靶向性,我们对不同类型的肿瘤分别添加阻断组,即给予scFv-Z@FRT前先加入游离scFv（30×）进行阻断实验。为评估CAF及胶原清除情况,我们通过向每只小鼠的左右后肢皮下各注射106个4T1细胞构建裸鼠双侧4T1肿瘤模型。当肿瘤大小达到100 mm3时,向小鼠体内静脉注射scFv-Z@FRT（n=3）。24小时后,使用671 nm激光（300mW/cm2,15分钟）照射右侧肿瘤,同时左侧肿瘤用铝箔覆盖。治疗后2天处死小鼠,制作肿瘤切片并用抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体染色检测CAF清除情况。此外,通过Mason三色染色检测肿瘤ECM中胶原的含量。为研究纳米颗粒在肿瘤中的累积和渗透效应,我们同样采用上述动物模型,照射后48小时分别为小鼠静脉注射1 nmol IRDye800CW（ex/em=780/800 nm）标记的BSA（5mg/kg）、10 nm聚乙二醇化CdSSe/ZnS QD或50 nm聚乙二醇化QD（每组n=5）。在注射后5分钟、10分钟、30分钟、1小时、4小时和24小时进行体内显像。在24小时显像后,处死小鼠并收集肿瘤,使用藻红蛋白标记的抗CD31抗体孵育标本进行免疫荧光染色分析,以观察BSA及QD的外渗及扩散情况。3.使用高压均化器制备HANP/Ce6。在EDC和NHS的存在下合成HA和5β-胆烷酸结合物HA-5β-CA。将Ce6溶液在超声处理15分钟后溶解在DMSO中,然后缓慢加入HANP溶液中并均化10分钟,除去游离的Ce6后获得HANP/Ce6。基于游离Ce6的标准曲线分析样品,观察到Ce6浓度与其吸光度之间的线性关系,以计算其载药率。扫描HANP/Ce6的吸收光谱并与游离Ce6的吸收光谱进行比较。使用激发波长403 nm的荧光分光光度计测量HANP/Ce6和游离Ce6的荧光强度。使用动态光散射测量HANP/Ce6的粒径分布。分别在FBS、含10%FBS的细胞培养液、PBS和水中对HANP/Ce6及游离Ce6进行7天的稳定性实验。我们在有无透明质酸酶存在的情况下比较HANP/Ce6中Ce6的释放情况。为研究透明质酸酶存在与否与ROS生成量的关系,我们使用DCFH-DA试剂盒检测游离Ce6、含或不含透明质酸酶的HANP/Ce6中的ROS生成量。4.为测定HANP/Ce6的靶向性,我们选用HT29细胞和NIH3T3细胞,各分为HANP/Ce6处理组和游离Ce6处理组,分别加入HANP/Ce6和游离Ce6（20μg/mL）。为了验证HA与CD44结合的特异性,将HT29细胞中增加HA阻断组。DAPI染色后使用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察。培育HT29细胞并分为HANP/Ce6处理组及游离Ce6处理组,在分别给药后给予激光照射,以检测ROS生成能力。为研究细胞毒性,我们分别用不同浓度的HANP/Ce6和游离Ce6（40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和2.5μg/mL）处理HT29细胞,之后再分别使用或不使用激光照射,通过MTT法评估细胞活力,并使用Calcein-AM/PI共染色进一步验证。构建裸鼠HT29肿瘤模型,当肿瘤生长至60 mm3时,随机分为HANP/Ce6组和Ce6组（每组n=3）,分别给小鼠尾静脉注射HANP/Ce6（5 mg/kg等量的Ce6）和Ce6。在静脉注射后1小时、2小时、4小时、6小时、12小时和24小时进行小动物荧光成像。在注射后4小时处死小鼠,收集肿瘤和心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉并进行荧光成像。仍然使用裸鼠HT29肿瘤模型,将荷瘤小鼠随机分为以下五组（每组n=5）:（1）生理盐水组、（2）游离Ce6激光照射组、（3）游离Ce6无激光照射组、（4）HANP/Ce6激光照射组、（5）HANP/Ce6无激光照射组。分别监测肿瘤大小、小鼠体重,并进行PET扫描和图像分析。在PDT结束两周后处死小鼠,取各组小鼠的肿瘤及主要器官,使用HE染色进行分析。结果:1.成功合成两类粒径不同的新型靶向纳米光敏剂scFv-Z@FRT及HANP/Ce6,二者均具有良好的稳定性、水溶性及ROS生成能力。2.scFv-Z@FRT可通过scFv-FAP相互作用与不同类型的肿瘤（原发性4T1肿瘤细胞及LL/2肝、肺转移瘤细胞）结合,并能被游离scFv阻断。在双侧4T1肿瘤模型的肿瘤中,经PDT治疗后,α-SMA染色阳性水平显着降低,Mason三色染色显示胶原含量明显减少,说明由于scFv-Z@FRT介导的PDT使CAF及胶原得已清除。PDT治疗后,给予不同粒径的大分子/纳米颗粒（BSA、10 nm QD、50 nm QD）,观察到肿瘤中不同粒径纳米颗粒的累积效应均得到改善。免疫荧光染色显示,不同粒径的纳米颗粒都表现出血管外渗现象。而粒径相对较大的纳米颗粒（50 nm QD）在肿瘤周围区域积聚,表明PDT诱导ECM的分解对于粒径相对较大的纳米颗粒在肿瘤中扩散能力的改善仍然有限。3.透明质酸酶降解HANP使HANP/Ce6中的Ce6释放后能检测到荧光。使用透明质酸酶后Ce6释放量较未使用透明质酸酶组明显增加。与封装入HANP的Ce6相比,Ce6从HANP中释放后产生更多的ROS。HANP/Ce6靶向性研究中,CD44阳性细胞能够大量摄取HANP/Ce6,并且能被HA阻断,说明其良好的CD44靶向性。在ROS生成能力研究中,经游离Ce6或HANP/Ce6处理的HT29细胞中,ROS的生成量均随Ce6浓度的升高而持续增多。但HANP/Ce6生成ROS的能力明显优于游离Ce6。HANP/Ce6具有良好的细胞毒性,激光照射HANP/Ce6组的细胞时,细胞存活率随HANP/Ce6浓度的增高而降低。HANP/Ce6激光照射组仅有13.05%±1.43%的细胞在40μg/mL（等量的Ce6）的浓度下保持存活。小鼠静脉给药后,荧光显像显示HANP/Ce6在肿瘤区域及肝脏中大量聚积,在给药后4小时肿瘤荧光信号达到峰值,而其他主要器官及组织中未见明显的荧光信号。对HT29荷瘤小鼠进行PDT后,与对照组相比,HANP/Ce6激光照射组小鼠的肿瘤生长出现显着抑制,并且没有观察到可检测的副作用,在组织学分析中也得到了证实。在疗效监测方面,肿瘤大小的变化与18F-FDG摄取变化一致。在治疗开始后不久即发生PDT诱导的细胞死亡,并且18F-FDG PET显像技术能在观察到肿瘤大小变化之前有效地监测早期肿瘤PDT反应。结论:本研究成功构建了两类不同粒径的新型靶向纳米光敏剂scFv-Z@FRT和HANP/Ce6,二者均具有良好的稳定性、水溶性、生物相容性及ROS生成能力。scFv-Z@FRT以铁蛋白作为载体,在包封光敏剂ZnF16Pc的同时,也改善了其生物相容性。scFv通过与FAP特异性结合而具有CAF靶向性,从而能在PDT中有效地清除CAF,继而使肿瘤中纳米颗粒的累积和渗透效应得到改善。铁蛋白以其良好的性质,作为纳米平台在药物和显像剂的递送方面显示出广阔的研究前景。另外,肿瘤间质靶向也为肿瘤靶向纳米药物和PDT提供新的设计思路。由于FAP在大多数实体瘤中呈高表达,因此预期该方法可在其他类型的肿瘤中有效地发挥作用。这种改善纳米颗粒的累积和渗透效应的PDT有望作为其他纳米药物的治疗前应用,具有潜在的研究价值。另一方面,HANP/Ce6具有主动和被动双靶向作用,即通过CD44靶向和高通透性和滞留（EPR）效应大量聚积在肿瘤中,将其应用于PDT中可减小给药剂量并提高疗效。HANP这一药物输送平台对于改善其他疏水性药物性能方面具有潜在应用价值。同时,应用18F-FDG PET显像技术监测疗效,与以肿瘤大小变化为指标的传统监测方法相比,能够更早地监测到肿瘤治疗反应,从而及时指导临床调整给药剂量及治疗方案。