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目的：骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种常见的退行性疾病，预计到2020年将成为导致残疾的第四大原因，但目前并没有任何有效治愈此病的药物。临床上，针对骨关节炎的治疗多采用药物治疗和手术治疗，但都存在各自的缺陷。软骨细胞过度凋亡和衰老被认为是骨关节炎发展的主要病理变化。以前的研究表明，通过药物或基因手段调控自噬能够抑制软骨细胞的凋亡和衰老。转录因子EB（TFEB）是自噬的重要调节因子，能启动自噬相关基因的转录翻译并介导溶酶体产生和活化。进行该研究明确TFEB是否参与骨关节炎发生进展，明确其所扮演的角色，及其具体作用机制与自噬的关系。
方法：手术切除小鼠膝关节内侧半月板韧带构建骨关节炎失稳模型（DMM模型），利用组织免疫荧光检测分析实验性小鼠骨关节炎的软骨细胞内TFEB的核内转录定位水平。体外消化分离小鼠乳鼠关节软骨组织，提取培养原代软骨细胞，利用叔丁基过氧化氢（TBHP）作为活性氧（ROS）供体诱导氧化应激在体外模拟骨关节炎的发生发展，分离核质蛋白并用westernblot法检测TBHP刺激下软骨细胞核内外TFEB蛋白的表达水平。利用慢病毒转染软骨细胞构建TFEB过表达的软骨细胞，siRNA介导软骨细胞内TFEB基因的敲除，用westernblot法检测软骨细胞凋亡、衰老及自噬水平的变化，用TUNEL染色检测软骨细胞的凋亡情况，用β-半乳糖苷酶染色检测软骨细胞的衰老水平，Lysotracker染色评估软骨细胞内溶酶体数量。再进一步用自噬抑制剂chloroquine（CQ）抑制自噬后，用上述同样方法判断TFEB对TBHP介导的软骨细胞凋亡和衰老是否需要自噬流的参与。最后动物体内实验中，我们将C57BL/6小鼠分为3组，分别如下：sham+LV-NC组，DMM+LV-NC组，DMM+LV-TFEB组。分别在术后15,30,45天这三个时间点在小鼠关节腔内注射慢病毒，在术后2月，处死小鼠，膝关节取材，X射线、番红-固绿染色评估小鼠膝关节炎的影像学和组织学改变。免疫组化评估关节软骨内TFEB，LC3-Ⅱ，p62，p16INK4a的表达水平并用TUNEL染色评价软骨细胞的凋亡水平。
结果：体外实验TBHP刺激能有效诱导软骨细胞氧化应激，引起细胞凋亡和衰老，成功了模拟骨关节炎中软骨细胞的病理变化。组织免疫荧光和westernblot的结果显示在骨关节炎的小鼠软骨组织内以及TBHP处理的软骨细胞中，TFEB的核定位下降，提示在骨关节炎的发展过程中TFEB的活性逐渐降低。TBHP处理软骨细胞后，westernblot检测结果显示由凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3）和衰老相关蛋白（p16INK4a）表达量的增加；TUNEL染色显示，软骨细胞的凋亡数量增加；β-半乳糖苷酶染色显示软骨细胞的衰老数量增加。利用慢病毒过表达TFEB后，能够明显逆转TBHP介导软骨细胞的凋亡和衰老。相反地是，使用siRNA敲除TFEB基因发现TBHP介导软骨细胞的凋亡和衰老被加重。TBHP处理软骨细胞后，westernblot检测结果显示由自噬底物p62增加，溶酶体膜蛋白（LAMP2）减少，溶酶体酶蛋白（CTSB）减少；荧光免疫双标染色（标记LC3-Ⅱ与LAMP2）结果显示：自噬体与溶酶体的结合减少；Lysotracker染色结果显示：溶酶体的数量和功能下降。提示TBHP导致了软骨细胞的溶酶体功能障碍和自噬流的阻断。提示利用慢病毒过表达TFEB后，能够明显修复TBHP介导软骨细胞的自噬流阻断和上调溶酶体功能。在使用溶酶体碱化剂CQ（被专用于自噬下游的阻断剂），TUNEL染色和β-半乳糖苷酶染色结果显示，当自噬流被抑制后TFEB所介导的对软骨细胞的保护作用被减弱消除，提示TFEB通过改善自噬流的通畅对抗TBHP所介导的软骨细胞凋亡和衰老。此外，免疫荧光显示TFEB过表达能减轻TBHP介导的细胞外基质2型胶原的降解，基质降解蛋白MMP-13的表达。体内实验结果显示，相对于DMM+LV-NC组，DMM+LV-TFEB组中小鼠关节的退变等级减轻，组织学染色显示组织退变得到改善。免疫组化（标记LC3-Ⅱ，p62，p16INK4a）和TUNEL染色结果显示，TFEB过表达促进了软骨细胞的自噬水平，减少了凋亡和衰老的发生。
结论：在小鼠DMM模型中软骨细胞内TFEB的活性降低。TFEB过表达上调了软骨细胞自噬水平和溶酶体功能，可进一步保护软骨细胞免受TBHP刺激导致的细胞凋亡和衰老。此外，我们的体内实验证实，TFEB过表达可改善小鼠骨关节炎的进展。这些结果表明TFEB可被认为是治疗骨关节炎的潜在靶标。
方法：手术切除小鼠膝关节内侧半月板韧带构建骨关节炎失稳模型（DMM模型），利用组织免疫荧光检测分析实验性小鼠骨关节炎的软骨细胞内TFEB的核内转录定位水平。体外消化分离小鼠乳鼠关节软骨组织，提取培养原代软骨细胞，利用叔丁基过氧化氢（TBHP）作为活性氧（ROS）供体诱导氧化应激在体外模拟骨关节炎的发生发展，分离核质蛋白并用westernblot法检测TBHP刺激下软骨细胞核内外TFEB蛋白的表达水平。利用慢病毒转染软骨细胞构建TFEB过表达的软骨细胞，siRNA介导软骨细胞内TFEB基因的敲除，用westernblot法检测软骨细胞凋亡、衰老及自噬水平的变化，用TUNEL染色检测软骨细胞的凋亡情况，用β-半乳糖苷酶染色检测软骨细胞的衰老水平，Lysotracker染色评估软骨细胞内溶酶体数量。再进一步用自噬抑制剂chloroquine（CQ）抑制自噬后，用上述同样方法判断TFEB对TBHP介导的软骨细胞凋亡和衰老是否需要自噬流的参与。最后动物体内实验中，我们将C57BL/6小鼠分为3组，分别如下：sham+LV-NC组，DMM+LV-NC组，DMM+LV-TFEB组。分别在术后15,30,45天这三个时间点在小鼠关节腔内注射慢病毒，在术后2月，处死小鼠，膝关节取材，X射线、番红-固绿染色评估小鼠膝关节炎的影像学和组织学改变。免疫组化评估关节软骨内TFEB，LC3-Ⅱ，p62，p16INK4a的表达水平并用TUNEL染色评价软骨细胞的凋亡水平。
结果：体外实验TBHP刺激能有效诱导软骨细胞氧化应激，引起细胞凋亡和衰老，成功了模拟骨关节炎中软骨细胞的病理变化。组织免疫荧光和westernblot的结果显示在骨关节炎的小鼠软骨组织内以及TBHP处理的软骨细胞中，TFEB的核定位下降，提示在骨关节炎的发展过程中TFEB的活性逐渐降低。TBHP处理软骨细胞后，westernblot检测结果显示由凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3）和衰老相关蛋白（p16INK4a）表达量的增加；TUNEL染色显示，软骨细胞的凋亡数量增加；β-半乳糖苷酶染色显示软骨细胞的衰老数量增加。利用慢病毒过表达TFEB后，能够明显逆转TBHP介导软骨细胞的凋亡和衰老。相反地是，使用siRNA敲除TFEB基因发现TBHP介导软骨细胞的凋亡和衰老被加重。TBHP处理软骨细胞后，westernblot检测结果显示由自噬底物p62增加，溶酶体膜蛋白（LAMP2）减少，溶酶体酶蛋白（CTSB）减少；荧光免疫双标染色（标记LC3-Ⅱ与LAMP2）结果显示：自噬体与溶酶体的结合减少；Lysotracker染色结果显示：溶酶体的数量和功能下降。提示TBHP导致了软骨细胞的溶酶体功能障碍和自噬流的阻断。提示利用慢病毒过表达TFEB后，能够明显修复TBHP介导软骨细胞的自噬流阻断和上调溶酶体功能。在使用溶酶体碱化剂CQ（被专用于自噬下游的阻断剂），TUNEL染色和β-半乳糖苷酶染色结果显示，当自噬流被抑制后TFEB所介导的对软骨细胞的保护作用被减弱消除，提示TFEB通过改善自噬流的通畅对抗TBHP所介导的软骨细胞凋亡和衰老。此外，免疫荧光显示TFEB过表达能减轻TBHP介导的细胞外基质2型胶原的降解，基质降解蛋白MMP-13的表达。体内实验结果显示，相对于DMM+LV-NC组，DMM+LV-TFEB组中小鼠关节的退变等级减轻，组织学染色显示组织退变得到改善。免疫组化（标记LC3-Ⅱ，p62，p16INK4a）和TUNEL染色结果显示，TFEB过表达促进了软骨细胞的自噬水平，减少了凋亡和衰老的发生。
结论：在小鼠DMM模型中软骨细胞内TFEB的活性降低。TFEB过表达上调了软骨细胞自噬水平和溶酶体功能，可进一步保护软骨细胞免受TBHP刺激导致的细胞凋亡和衰老。此外，我们的体内实验证实，TFEB过表达可改善小鼠骨关节炎的进展。这些结果表明TFEB可被认为是治疗骨关节炎的潜在靶标。