论文部分内容阅读
B、T淋巴细胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是2003年发现的CD28家族共抑制受体，主要表达于T、B细胞，在DC、单核细胞及NK细胞上也有表达，能负性调节T、B细胞的激活与增殖，维持树突状细胞在内环境中的稳定，抑制记忆性CD8+T细胞的分化。BTLA在肿瘤患者T细胞上高表达，本课题组以往研究工作中发现人类结直肠癌组织中高表达BTLA，主要表达于肿瘤浸润性淋巴细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞。提示BTLA可能在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。为了进一步研究BTLA在与肿瘤发病的关系，本研究构建了表达小鼠BTLA(mBTLA)的慢病毒转移载体，并感染小鼠结肠癌细胞株，建立mBTLA稳定高表达的小鼠结直肠癌细胞，为进一步研究BTLA在肿瘤的发生、发展和侵袭转移中的作用奠定基础。 [目的] 构建表达mBTLA的慢病毒转移载体，感染小鼠结肠癌CT26细胞，获得稳定表达mBTLA的小鼠结肠癌细胞株，并对mBTLA在CT26细胞中的表达进行鉴定。为进一步研究BTLA在结直肠癌发病中的作用奠定基础。 [方法] 1.以pET-28a-mBTLA质粒为模板，PCR扩增mBTLA全长片段，酶切插入到pMD18-T克隆载体，基因测序证实其插入序列与Genebank中登录序列否完全一致。 2.XhoI和XbaI双酶切pMD18-T-mBTLA和慢病毒骨架专用质粒pSL6(即:pRRL-cPPT-CMV-X-PRE-SIN质粒，其中X代表酶切插入位点)，胶回收后连接获得pSL6-mBTLA转移载体，将pSL6-mBTLA转移载体与pCMV-VSVG、pMDLg/ pRRE和pRSV-REV三个包装载体共转染293T细胞，获得表达小鼠BTLA的慢病毒Lenti-mBTLA。同时以pSL6为转移载体获得表达绿色荧光蛋白的对照慢病毒Lenti-EGFP。 3.倒置荧光显微镜观察GFP蛋白表达，TCID50法（50％组织培养感染剂量法）测定慢病毒滴度。 4.将Lenti-mBTLA感染小鼠结肠癌CT26细胞，RT-PCR和Western Blotting鉴定小鼠BTLA表达，流式分选建立mBTLA高表达结肠癌细胞株(CT26-BTLA)。 5.显微观察CT26-BTLA细胞株形态学变化，流式检测BTLA过表达CT26细胞株细胞周期和凋亡的影响。 [结果] 1.成功构建Lenti-mBTLA和Lenti-EGFP慢病毒，经纯化、滴度测定后Lenti-mBTLA和Lenti-EGFP分别为1.3×108 pfu/ml和1.0×108 pfu/ml。 2.RT-PCR和Western Blotting鉴定Lenti-mBTLA稳定表达小鼠BTLA。 3.获得小鼠BTLA高表达结肠癌细胞株CT26-BTLA，显微观察CT26-BTLA细胞呈细长多边形。流式检测BTLA高表达对CT26细胞周期和凋亡无明显影响。 [结论] 成功构建Lenti-mBTLA，并获得高表达mBTLA结肠癌细胞株CT26-BTLA，BTLA高表达对CT26细胞周期和凋亡无明显影响。为进一步研究BTLA在结直肠癌中的作用奠定了基础。