半胱胺调控斜带石斑鱼生长的分子机理研究

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鱼类生长的内分泌调控是通过刺激性和抑制性因子的双重作用来实现的。生长抑素(somatostatin,SS)正是生长激素(growth hormone,GH)基础性和刺激性分泌的最主要的抑制性因子。半胱胺可以通过抑制或削弱生长抑素作用,直接或间接的刺激GH的释放,从而促进生长。本论文首次从斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)肝脏克隆了2种不同类型的斜带石斑鱼生长激素受体(gGHR1和gGHR2)。比较了2种生长激素受体的分子结构,同源性以及进化关系。运用Real-time PCR技术结合Northern杂交技术对2种生长激素受体在斜带石斑鱼不同组织表达情况进行了研究;通过RT-PCR技术研究了2种生长激素受体在斜带石斑鱼胚胎发育过程中的表达情况。通过拌料投喂实验,研究了不同剂量半胱胺(CS)以及促黄体素释放激素类似物(LHRH-A)对斜带石斑鱼幼鱼生长的影响,从而寻找出一种合适剂量的CSH与LHRH-A药物组合,指导斜带石斑鱼的人工养殖。 本研究采用.RT-PCR以及RACE技术,从斜带石斑鱼肝脏克隆了2种不同类型的生长激素受体cDNA。斜带石斑鱼生长激素受体1型(gGHRl)cDNA全长2673bp(NCBI GenBank序列号,EF052273),编码658个氨基酸,其中胞外区为273个氨基酸,单次跨膜区为21个氨基酸,胞内区为364个氨基酸;斜带石斑鱼生长激素受体2型(gGHR2)cDNA全长2989bp(NCBI GenBank序列号,EF052274),编码577个氨基酸,其中胞外区为244个氨基酸,单次跨膜区为20个氨基酸,胞内区为314个氨基酸。2种gGHR序列拥有78.6﹪的核苷酸同源性以及37.8﹪的氨基酸同源性。通过Northern杂交实验,我们在斜带石斑鱼肝脏组织检测到了单一的gGHR1信号,同时在斜带石斑鱼肝脏和肌肉组织测到了单一的gGHR2信号。在不同种类硬骨鱼生长激素受体同源性分析中我们发现,斜带石斑鱼gGHR1同鲈形目(黑鲷,金头鲷,尼罗罗非鱼)以及鲽形目(牙鲆,大菱鲆)鱼类的GHRl具有很高的同源性(81.3﹪.86.9﹪);斜带石斑鱼gGHR2同鲈形目的一些鱼类(黑鲷,金头鲷,尼罗罗非鱼)的GHRl具有很高的同源性(71.8﹪-80.4﹪)。 对硬骨鱼生长激素受体的进化关系也进行了分析。斜带石斑鱼生长激素受体同鲈形目以及鲽形目的一些鱼类的生长激素受体具有较近的进化亲缘关系,而与鲤形目,鲶形目,鲑形目和鳗形目的一些鱼类的生长激素受体具有较低的进化亲缘关系。 采用Real-time PCR技术对斜带石斑鱼2种gGHR的组织分布情况进行了研究。在垂体,下丘脑,脊髓,心脏,肝脏,肌肉等18种被测组织中均有检测到2种gGHR的表达。在脑区,gGHR1在垂体中的表达量最高,在小脑和下丘脑的表达量最低;gGHR2在垂体,端脑和小脑的表达量最高,在下丘脑的表达量最低。在外周组织,2种gGHR在肝脏表达量最高,其次是肌肉和脂肪,而在其他外周组织表达量很低。同时采用Real-time PCR技术还比较了在同一组织中2种gGHR的表达差异。在大多数组织,如:端脑,小脑,垂体,心脏和肌肉,gGHR2的表达量明显高于gGHRl;而在肝脏和脊髓,gGHRl的表达量明显高于gGHR2。同时采用RT-PCR技术研究了2种生长激素受体在斜带石斑鱼胚胎发育过程中的表达情况。斜带石斑鱼2种GHR mRNA在受精卵初期就可以检测到表达,并且在胚胎发育各个时期都有显著表达。 半胱胺盐酸盐(CSH)单独投喂实验发现,不同剂量的CSH均能显著促进斜带石斑鱼幼鱼的生长,提高鱼体的肥满度,对鱼体的内脏比例没有影响。CSH的促生长效果在一定范围内与剂量成正比。同时,运用:Real-time PCR技术对不同处理后的斜带石斑鱼GH及2种gGHR mRNA水平进行分析,发现CSH可以剂量依存的方式促进斜带石斑鱼脑垂体GH mRNA水平;同时,低剂量的CSH(1-3mg/g diet)可以剂量依存的方式提高斜带石斑鱼肝脏2种gGHR mRNA水平;而高剂量的CSH(4mg/g diet)则抑制2种gGHR mRNA水平,这可能同低剂量的GH对GHR的上调节以及高剂量的GH对GHR的下调节有关。此外还发现,对于CSH刺激的敏感度上,gGHR2要明显高于gGHR1。促黄体素释放激素类似物(LHRH-A)单独投喂实验结果表明,不同剂量的LHRH-A均能显著促进斜带石斑鱼幼鱼的生长,提高鱼体的肥满度,同时对鱼体的内脏比例没有影响。其对斜带石斑鱼幼鱼的促生长效果在一定范围内与剂量成正比。 最后通过混合投喂实验,我们发现CSH与LHRH-A混合投喂能显著促进斜带石斑鱼幼鱼的生长,其促生长效果要明显高于CSH或LHRH-A单独投喂。在促进生长的同时,混合投喂还能明显提高饲料的转化率,鱼体肥满度以及肌肉RNA/DNA比率,而且对鱼体可食部分比例没有影响。所有结果表明,CSH与LHRH-A混合使用是一种经济有效的斜带石斑鱼促生长剂,可以广泛应用于斜带石斑鱼的人工养殖中。
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