与中国南瓜Rboh D互作的CBL-CIPK鉴定

• 作 者: 周利剑
• 机 构: 华中农业大学
• 出 处: 华中农业大学
• 发表日期: 2021年01期
• 关键词: 盐胁迫 南瓜 Rboh CIPK 蛋白互作
• 基金项目: 国家自然科学基金（32072653）；

随着我国设施蔬菜种植规模不断扩大和化学肥料过量施用,设施土壤次生盐渍化等问题不断加剧。黄瓜的耐盐性较弱,常采用更加耐盐的南瓜作为砧木嫁接黄瓜。课题组前期研究发现,南瓜砧木能提高黄瓜耐盐性主要是通过控制砧木根系早期H2O2信号爆发,增强了根系Na+外排能力,并通过促进盐胁迫下早期的叶片气孔关闭,使嫁接苗更好地适应盐胁迫。呼吸爆发氧化酶同源物（Rboh）介导H2O2生成,在植物生长发育和逆境环境响应中发挥了重要作用。Rboh蛋白N端含有能够结合Ca2+的EF结构域和潜在的磷酸化位点。CIPK是钙信号转导中的重要激酶,课题组前期研究已经鉴定出了中国南瓜中的所有CIPK基因家族成员,发现多个CmoCIPK基因在盐胁迫下的表达量发生变化,表明CmoCIPKs也参与了中国南瓜响应盐胁迫的过程。因此,本论文研究从筛选与响应盐胁迫的关键CmoRboh蛋白相互作用的CmoCIPK蛋白成员等方面展开,所取得的结果如下:1.分析转录组中盐胁迫下不同组织CmoRbohs基因家族的表达水平,发现CmoRboh D1和CmoRboh D2在根系中受盐胁迫诱导上调表达。利用在线网站比较了在响应盐胁迫中发挥重要功能的CmoRboh D1和CmoRboh D2的蛋白序列和跨膜结构域,结果表明,CmoRboh D1和CmoRboh D2是典型的Rboh蛋白,属跨膜蛋白,两者均有4个跨膜结构域,蛋白序列N端较长。两者氨基酸序列相似性高达90.74%。2.利用酵母双杂点对点实验,从29个CmoCIPK蛋白中筛选出与CmoRboh D1、CmoRboh D2蛋白N端互作的均为CmoCIPK1,属拟南芥At CIPK11同源基因。利用萤火虫荧光素酶互补实验和蛋白质免疫共沉淀实验进一步验证了CmoCIPK1和CmoRboh D1、CmoRboh D2的互作关系。亚细胞定位实验表明,CmoCIPK1和CmoRboh D1、CmoRboh D2一样,均定位在质膜上。3.利用酵母双杂点对点实验,从9个CmoCBL蛋白中筛选出与CmoCIPK1互作的为CmoCBL1、CmoCBL2、CmoCBL3、CmoCBL7、CmoCBL8、CmoCBL9,萤火虫荧光素酶互补实验进一步验证了这一结果。4.分析转录组中盐胁迫下不同组织CmoCIPKs、CmoCBLs基因家族的表达水平,发现CmoCIPK1在砧木茎中表达量最高,其次是根系,暗示其在盐胁迫感应和信号传递中可能发挥着作用;与CmoCIPK1互作的6个CmoCBL在盐胁迫下表达水平不尽相同,可以分为4类,相关结果有待深入研究。5.在大肠杆菌中成功诱导并纯化CmoRboh D1、CmoRboh D2蛋白,在线预测显示CmoRboh D1和CmoRboh D2蛋白N端含有较多磷酸化位点,通过体外磷酸化实验和LC-MS/MS技术,预测CmoRboh D1、CmoRboh D2蛋白磷酸化位点,将是后续工作重点。