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本文对L-赖氨酸脱羧酶的酶学性质、蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009的发酵转化条件以及固定化细胞发酵工艺进行了研究。利用H.alvei AS1.1009 L-赖氨酸脱羧酶将L-赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺(尸胺)。
1,5-戊二胺是重要的医药中间体和尼龙材料前体,在农业上常常被应用于果实催熟,提高水果产量,产品附加值很高。目前我国化学工业还未大量开发此产品,即便是日本味之素公司,也仅使用游离的基因工程菌进行发酵生产,菌体重复利用率低,操作繁琐。本文采用固定化细胞酶法转化工艺,使1,5-戊二胺工业化开发难题获得初步解决。
为获得H.alvei AS 1.1009菌株的最佳发酵条件,通过培养条件优化,得出最佳培养基(g/L)配方为:每升培养基中含蔗糖20g、玉米浆20g、酵母膏3g、牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、硫酸铵2g、维生素B65g和L-赖氨酸5g。pH7.2。最佳培养条件为:温度37℃,培养基装量100ml,接种量体积比5%,发酵时间16h。
对H.alvei AS 1.1009菌株L-赖氨酸脱羧酶酶性质进行研究,得到制备,5-戊二胺的最佳转化条件为:转化体系温度37℃,pH5.0,菌体浓度10g/L,吐温-800.15g/L,菌龄16h,底物浓度10g/L。L-赖氨酸脱羧酶在最适转化条件下比酶活可以达到1043.3U。其中70%左右L-赖氨酸可以转化为1,5-戊二胺。经真空旋转蒸发仪和油浴精馏可实现产物底物分离。还考察了L-赖氨酸经脱羧酶生物转化生成尸胺的反应动力学,该生物转化反应半衰期为10.58h。从D-赖氨酸添加上看,并没有出现所谓的同型底物的竞争抑制作用。
研究了几种固定化蜂房哈夫尼菌(Halvei AS1.1009)菌体细胞材料,其中海藻酸钙包埋法稳定性最好,比酶活可达1028.9U。该方法最优转化条件为:在ρ(海藻酸钠)=30g/L的水溶液中,最适菌体质量浓度为ρ(菌体)=30.8g/L,100mL转化液中海藻酸钙球体体积为30mL,转化最适温度为37℃,最适pH为5.0。第一批固定化细胞酶活可达游离菌体的98.62%,第四批可达第一批酶活的38.68%。以上工艺原料价格低廉,转化率高,工艺流程简单,适合工业化生产。