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研究目的:近年来已有大量研究证明诱导多能干细胞(hi PSCs)来源的小胞外囊泡(s EVs)(hi PSCs-s EVs)在各类疾病中发挥治疗作用,然而目前对于s EVs来源供体细胞的收集培养上清时所用培养液条件及细胞状态并没有明确的报道,因此本文研究的目的是探索在提取hi PSCs-s EVs时,hi PSCs的培养条件及其能否维持细胞的正常状态,以确保在减少外来物质对s EVs干扰的同时提取具有生物学活性的s EVs。1、根据hi PSCs的生长及分化状态确定收集培养上清时所需条件培养基的组成;2、进一步确定可收集培养上清的天数;3、改良s EVs的提取方法提取hi PSCs来源的s EVs;4、通过检测形态、大小等验证提取的s EVs的物理学特性;5、验证s EVs表面标志蛋白的表达;6、利用Hep G2细胞证明提取的s EVs的生物学活性。研究方法:1、利用连续16h超速离心法制备去除细胞外囊泡的血清替代物(KSR)(ED-KSR);2、配制含有不同浓度(0%、0.25%、0.5%、2%、5%和20%)ED-KSR的条件培养基(CM);3、hi PSCs生长至一定密度后更换不同浓度CM,24h后利用相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测不同浓度CM中细胞的生存率,BCA和SDS-PAGE分别测定不同浓度CM中提取出的s EVs蛋白浓度以及条带分布,并确定最适宜的ED-KSR浓度;4、在0.5%CM中连续收集培养上清5d,并利用流式细胞仪测定分别收集1d,3d,5d时hi PSCs的存活率,碱性磷酸酶染色(ALP)、干性标志物OCT4、SEEA4和SOX2的免疫荧光染色、干性标志物NANOG、OCT4和SOX2的q RT-PCR分析检测hi PSCs的多能性,确定收集培养上清的时间;5、采用改良的超速离心法(M-UC)和Exo-Quick试剂盒(EQ)提取s EVs,并利用透射电子显微镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)、蛋白印迹(WB)验证所提取的s EVs的大小、形态以及蛋白表达;6、PKH67标记s EVs,鉴定是否能被受体细胞Hep G2摄取;7、不同浓度的s EVs加入到Hep G2中,观察其对受体细胞的作用。研究结果:更换0%、0.25%、0.5%、2%、5%和20%六种浓度ED-KSR配制的CM 24h后,相差显微镜下观察两株hi PSCs的形态,发现与干细胞培养基中培养的hi PSCs相比,0.5%、2%、5%和20%CM中的细胞形态没有显著变化,均呈特征性的未分化状态,且流式细胞仪检测结果的数据分析显示各组间差异无统计学意义(P>0.05),然而,0%和0.25%CM中hi PSCs的形态已经发生轻微改变,并开始出现分化现象,细胞存活率也显著低于对照组(P<0.05);BCA结果显示0.5%、2%、5%和20%CM中收集的来源于两株hi PSCs的s EVs的蛋白浓度分别为4.36±0.53、7.5±2.0、10.2±1.2、14.99±1.12;4.36±0.54、7.14±0.68、10.67±1.84、13.63±0.06,各组间差异显著(P<0.05),且SDS-PAGE结果也显示KSR中的蛋白对0.5%CM中提取的s EVs干扰最小,上述结果均表明0.5%ED-KSR为适宜的CM浓度;随后在0.5%CM中连续收集培养上清5天后,发现细胞的形态无明显变化,且流式细胞仪检测结果显示hi PSCs的存活率有浮动,但数据分析显示此差异无统计学意义(P>0.05);碱性磷酸酶染色、OCT4、SEEA4和SOX2的免疫荧光、NANOG、OCT4和SOX2的q RT-PCR分析结果均显示hi PSCs在收集5天后仍表达hi PSCs多能性标志,呈未分化状态;采用M-UC和EQ两种方法提取s EVs,TEM结果显示提取的s EVs均为50-200nm,椭圆形或圆形的双层膜性小囊泡,NTA结果显示两种方法提取的s EVs大小分别为186.6±2.6 nm、167.5±2.0 nm,;Western Blotting结果显示两株hi PSCs细胞来源的s EVs表达标记蛋白CD63,TSG101和HSP70,不表达钙网蛋白Calreticulin;另外,PKH67染色实验表明,s EVs可被受体细胞Hep G2内吞,并以颗粒形式聚集在细胞质中,且达到一定浓度的s EVs可以促进细胞增殖。研究结论:在维持hi PSCs多能性及存活率的条件下,0.5%ED-KSR为收集hi PSCs培养上清时所用条件培养基的适宜浓度,并且可连续收集5天;M-UC和EQ两种方法均可提取具有促进受体细胞增殖的生物活性的s EVs,为后续的功能研究提供基础。