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研究背景粪肠球菌为革兰阳性兼性厌氧菌,它是再感染根管中检出率最高的细菌,在根管治疗失败及难治性根尖周炎中扮演着重要的角色。根管系统解剖结构复杂,存在机械预备与化学预备无法到达的部位,要完全清除根管系统内的细菌是不可能的。因此为防止根管再感染的发生,抑制根管内粪肠球菌生物膜再形成,维持根管系统内粪肠球菌数量低于致病量尤其重要。目前有关冲洗液性能的研究多集中于冲洗液杀菌性能的研究,有关冲洗液残余抗菌活性的研究较少。现今多用浸泡方法构建粪肠球菌感染模型,基于此模型的局限性,未能用激光共聚焦扫描显微镜等较快捷直观的方法,研究根管冲洗液残余对牙本质小管内粪肠球菌的抑制能力。近年有学者提出用离心方法构建牙本质感染模型,此方法建立的感染模型进入牙本质内的细菌更多,用于评价冲洗液灭菌性能结果更可靠。结合新的感染模型可更准确评价冲洗液残抑制粪肠球菌能力。研究目的本课题通过激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy)观察各冲洗液处理牙本质样本后,24h样本表面残留冲洗液对粪肠球菌生物膜形成的影响。选择出24h内,抑制细菌生物膜形成效果最好的根管冲洗液,然后用离心的方法,建立粪肠球菌感染模型,激光共聚焦扫描显微镜观察根管冲洗液处理此感染模型0d、7d后牙本质小管中粪肠球菌活菌情况。从牙本质表面与牙本质小管,两方面观察根管冲洗液抑制细菌生物膜形成情况,评价其残余抗菌活性,为临床选择控制粪肠球菌感染药物提供实验依据。材料和方法1.不同冲洗液残余药对牙本质表面粪肠球菌生物膜形成影响粪肠球菌复苏、厌氧培养与细菌鉴定,绘制粪肠球菌24h生长曲线。制备4mm×4mm×0.5mm牙本质片样本60个随机分成6组,样本分别浸泡于0.9%生理盐水(阴性对照组)、5.25%、2.5%次氯酸钠溶液、17%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液10%柠檬酸溶液和2%氯己定溶液中3min,随后将样本移入24孔板中,分别注入400μl预备好的粪肠球菌细菌悬液,厌氧培养24h,经LIVE/DEAD BacLight荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细菌生物膜形成情况,60倍水镜观察样本,每个样本随机抽取2个区域由内向外扫描获取X、Y、Z轴图像。共得120个区域扫描图片。Imaris7.2.3软件获取三维重建图片Bioimage-L软件统计三维重组图像活菌体积,SPSS13.0处理数据,各组生物膜观测指标间进行随机区组单因素方差分析(one-way ANOVA), SNK(Student-Neuman-Keuls)进行均数两两比较。获取每组平均活菌体积与阴性对照组平均活菌体积相比计算每组冲洗液平均抑制细菌生物膜形成比率。2.离心法构建牙本质块粪肠球菌感染模型选择因正畸拔除的健康前磨牙17颗,于釉牙骨质界下截取4mm长圆柱状牙本质块,GG钻扩大根管,纵向劈开,600目水磨砂纸去除牙骨质,并调整牙本质样本厚度,为2mm低速球钻调整样本宽度,使其与超滤离心管大小一致。最后制备33个4mm×4mm×2mm大小,半圆柱状牙本质块样本,去除牙本质块表面玷污层,随机抽取1个样本电镜观察玷污层去除情况。确定玷污层去除干净后,样本置于超滤离心管中,树脂封闭样本与管壁间隙。为检验定速离心的方法是否能使液体进入牙本质小管,先检验用定速离心的方法能否使结晶紫染料进入牙本质小管中,随机抽取5个预备好的牙本质块样本,加入结晶紫溶液后,按以下离心速度顺次离心1400g,2000g,3600g,和5600g,每次离心5min共离心两次,在每次离心中均去除渗出的结晶紫溶液,并加入新鲜结晶紫溶液。在另外5个牙本质块样本中加入结晶紫溶液静置24h。观察离心法是否能使染色液透过牙本质块。确定定速离心的方法有效后,随机抽取2个预备好的样本,加入粪肠球菌悬液,按上述离心法离心,吖啶橙染色液染色后倒置荧光显微镜观察。确定模型建立成功后将剩下的20个样本随机分成两组：A组加入粪肠球菌菌液后,按上述方法顺次定速离心；B组为空白对照组加入BHI液体培养基后顺次定速离心；两组分别随机抽取一半样本置于扫描电镜下观察,另一半样本经LIVE/DEAD BacLight荧光染色后,激光共聚焦扫描显微镜观察。3.冲洗液残余药量对本质小管内粪肠球菌生长的影响选择因正畸拔除的健康前磨牙6颗,按上述方法制备牙本质块样本。共制备12例4mm×4mm×2mm大小半圆柱状牙本质块样本,加入粪肠球菌菌液,按上述离心方法离心。将预备好的样本随机分成四组：5.25%次氯酸钠溶液0d组、5.25%次氯酸钠溶液7d组；2%氯己定溶液0d组,2%氯己定溶液7d组。样本分别经5.25%次氯酸钠溶液,与2%氯己定溶液处理。抽取0d组样本,经LIVE/DEAD BacLight荧光染色后激光共聚焦扫描显微镜观察,每个样本随机抽取2个区域观察。剩下的7d组样本置于厌氧菌培养箱中,培养7d后取出,LIVE/DEAD染色后,激光共聚焦扫描显微镜观察样本牙本质内细菌清除情况。Imaris7.2.3软件获取三维重建图片,Bioimage-L软件统计三维重组图像活菌体积计算每组样本活菌比例,SPSS13.0处理数据。结果1.24h内细菌生长曲线图显示,16h进入了稳定期。各组冲洗液对粪肠球菌生物膜均有不同程度的抑制作用。2%氯己定溶液组活菌数最少,能抑制99.9%细菌生物膜形成,次氯酸钠溶液组活菌数多,抑制细菌生物膜形成能力最差分别抑制13.3%、18.8%细菌生物膜形成,17%乙二胺四乙酸溶液与10%柠檬酸溶液抑制细菌生物膜形成能力次于2%氯己定溶液组,分别能抑制43.8%与45.3%细菌生物膜形成。2.成功建立粪肠球菌感染模型。定速离心组,见结晶紫染料从牙本质髓腔面渗透到牙骨质面,浸泡组牙本质表层髓腔面呈深紫色,深层牙本质组织清洁未见任何紫色染料存在。表明,离心方可以使结晶紫染色液透过牙本质,同样菌液也可以透过牙本质。荧光显微镜结果与激光共聚焦扫描显微镜观察结果,均显示,牙本质样本中有大量长短不一的绿色荧光。激光共聚焦扫描显微镜下,大部分牙本质小管被细菌浸润,属于重度感染模型。空白对照组未见有细菌浸润,仅见少量零散浅绿色荧光。扫描电镜观察结果显示：牙本质块髓腔面,可见大量粪肠球菌成团块状聚集于牙本质小管口,并浸润到牙本质小管内,牙本质小管内见大量细菌浸润,大部分细菌形态规则,阴性对照组未见细菌浸润,牙本质小管通畅,结构清晰,胶原纤维交织成网并嵌入管壁。3.结果显示,5.25%次氯酸钠溶液7d组活菌体积较5.25%次氯酸钠溶液0d组多,其差异具有统计学意义(P<0.05),2%氯己定溶液0d组活菌体积与2%氯己定溶液7d组相比无明显差异(P>0.05),表明,2%氯己定残余药液在7d内对牙本质小管内粪肠球菌具有一定程度的抑制作用；5.25%次氯酸钠残余药液在7d内对牙本质小管内粪肠球菌未显示出抑制作用。结论五种根管冲洗液24h内,均不同程度抑制牙本质表面粪肠球菌细菌生物膜形成,其中2%氯己定溶液能力最强,次氯酸钠最弱。离心方法建立的牙本质块粪肠球菌感染模型,细菌能浸润牙本质小管并侵入牙本质小管深部。2%氯己定溶液7d内可持续抑制牙本质小管内粪肠球菌生长。