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目的:当今社会经济文化飞速发展，人口老龄化进程加快，动脉粥样硬化、高血压、糖尿病的血管并发症等血管重塑性疾病已经严重地威胁着人类的健康，而经皮冠状动脉介入治疗术(PCI)后的血管再狭窄(restenosis，RS)也同样属于血管重塑性改变范畴。目前认为，血管重塑的主要病理基础之一是血管壁平滑肌细胞从中膜层向内膜下迁移与增殖。由于这类疾病的发病率高，危害大，并且RS的发生严重影响患者的远期治疗效果，因此备受社会关注。尽管已有大量文献报道血管损伤后引起血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖、迁移及细胞外基质产生的相关机制，然而至今尚未完全明确。因此，继续研究和阐明损伤因素引起的VSMC增殖、迁移及细胞外基质产生的相关机制，为预防和治疗这类疾病提供理论基础，具有重要意义。 科学家在对果蝇基因进行功能筛选时，第一次发现了Hippo-YAP信号通路。它主要由一些蛋白激酶组成，可以产生磷酸化级联反应，此过程还受到其他调节因子调控，以及转录共激活因子的参与，共同调节器官体积、细胞生长和凋亡。研究发现一些肿瘤发生涉及的分子生物学机制，在血管平滑肌有关的疾病（如动脉损伤后或动脉粥样硬化形成过程中的新生内膜形成）的发病机制中同样存在。近期研究表明，在心血管系统的发生、发育调节中Hippo-YAP通路起着不容忽视的作用，尤其是核心分子YAP不仅对心脏发育有着至关重要的作用，对血管发生以及平滑肌细胞增殖、迁移能力也有重要的调控作用。 WWC3是人类WWCs蛋白家族(WWC1，WWC2，WWC3)之一，仅有的研究结果显示WWC1能够通过其WW结构域与LATS1结合而影响其磷酸化从而调控Hippo通路，而WWC1，2，3均含有保守的WW，C2，ADDV结构域。因此我们猜想WWC3也可能通过WW结构域与LATS1形成复合体进而调节Hippo信号通路。 本文目的是探讨血管损伤后血管平滑肌细胞中WWC3的表达变化对Hippo-YAP信号通路的影响及可能的作用机制。 研究方法:选取体重350-400 g的健康雄性Wistar大鼠，采用颈动脉球囊损伤制备血管狭窄的动物模型。损伤后14天处死动物，分离并取出颈动脉。HE染色观察动物模型的建立，免疫组织化学染色、Western blot检测血管损伤对WWC3及Hippo通路相关因子表达的影响。 对VSMC（大鼠A10主动脉平滑肌细胞）给予PDGF-BB（10 ng/ml）处理模拟损伤。采用Western blot检测处理前后WWC3及Hippo通路相关因子的表达水平，荧光素酶报告基因检测Hippo信号通路活性，MTT、Transwell、划痕实验等方法分别检测细胞增殖和迁移能力的改变。 转染WWC3过表达质粒，检测WWC3对Hippo通路的影响。另外上调WWC3表达后再次给予PDGF-BB处理，采用荧光素酶报告基因检测诱导后VSMC中Hippo信号通路活性，Western blot检测LATS1和YAP磷酸化水平、下游靶基因CTGF、和Cyclin E的表达水平，采用MTT、Transwell等方法分别检测细胞增殖和迁移能力的改变。 为揭示WWC3激活Hippo通路活性的分子机制，验证WWC3影响Hippo通路活性依赖LATS1的存在，并通过与LATS1结合激活LATS活性，我们采用Westernblot、核浆蛋白分离、免疫荧光等方法检测Hippo通路中的关键因子YAP的表达和入核水平，免疫荧光检测VSMC中WWC3与LATS1是否存在共定位，免疫共沉淀检测WWC3与LATS1是否相互作用。构建和转染WWC3-△WW突变体，应用Western blot、免疫共沉淀的方法检测VSMC中WWC3与LATSl的结合情况及对Hippo通路的影响。 结果:1、大鼠颈总动脉球囊损伤后14天，可见管腔明显狭窄，内膜增生，与对照组比较有显著差异。免疫组化及Western blot结果显示WWC3表达下降，YAP、CTGF和Cyclin E的表达则升高。 2、应用PDGF-BB处理A10细胞4h后，WWC3的蛋白表达水平逐渐下调，而YAP、p-YAP、CTGF和Cyclin E则表达升高，24h达到峰值水平。荧光素酶报告基因检测显示Hippo信号通路转录子TEAD的转录活性明显增强，MTT、Transwell等检测显示细胞的增殖能力及迁移能力增加。 3、转染WWC3表达质粒后，与对照组相比Hippo信号通路主要成分p-LATS1和p-YAP表达上调，YAP下调，CTGF和Cyclin E等Hippo信号通路下游靶基因蛋白表达也受到抑制，此时Hippo信号通路转录子TEAD的转录活性则明显下降，细胞的增殖能力降低，迁移能力也受到了抑制。另外，我们在过表达WWC3后同样给予PDGF-BB处理，发现此时刺激不再对Hippo信号通路靶基因的蛋白表达水平有明显的影响，细胞的增殖和迁移能力亦没有明显改变。Hippo信号活性也没有受到影响。 4、免疫荧光实验发现PDGF-BB刺激后YAP蛋白在核内的表达明显增加，而转染WWC3后YAP在核内的表达量明显减少，此时再给予PDGF-BB刺激YAP在核内的表达较前减少。核浆蛋白分离后WB结果显示，PDGF-BB刺激后YAP在核和浆中的表达均出现增加，而转染WWC3后YAP在核内则明显减少，转染WWC3并给予PDGF-BB刺激，YAP蛋白在核内的表达也不会增加。 5、应用免疫共沉淀检测后发现，WWC3和LATS1存在相互作用。免疫荧光也提示WWC3和LATS1在细胞浆存在共定位。我们构建了WWC3的WW结构域缺失的剪接体WWC3-△ WW，免疫共沉淀结果显示转染WWC3-△ WW后，WWC3不再与LATS1发生相互作用。同时Western blot显示转染WWC3-△ WW后，p-LATS1、p-YAP，YAP，CTGF和CyclinE等蛋白表达与对照组相比均无明显改变。 结论:1、WWC3蛋白在损伤后的血管和PDGF-BB处理的平滑肌细胞中表达下调，并且损伤（或PDGF-BB处理）后的细胞增殖、迁移能力明显增强，而Hippo通路的保护抑制作用受到抑制。 2、恢复WWC3表达能够逆转损伤（或PDGF-BB处理）产生的细胞异常增殖和迁移能力的增加。 3、WWC3影响Hippo通路活性和细胞生物学功能依赖于与LATS1的相互作用。 4、WWC3可能通过其自身的WW结构域与LATS1的PY基序直接结合。 5、WWC3与LATS1结合后，在胞浆内促进LATS1磷酸化，从而抑制YAP核异位，进而通过Hippo通路在体内外发挥抑制血管损伤后血管平滑肌的增殖和迁移的作用。