重组羧肽酶原B包涵体质量及重组羧肽酶B稳定性研究

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本文利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)揭示了重组羧肽酶原B(recombinantprocarboxypeptidase B,rpCPB)包涵体中含有天然或类天然二级结构,并发现这些结构与包涵体的复性效率相关。论文利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析包涵体中二级结构,结合复性率,研究了培养条件以及不同表达质粒对pCPB包涵体构象质量的影响。   通过对培养条件的正交优化,发现培养温度对包涵体复性效率具有显著影响,诱导剂IPTG浓度对包涵体复性也具有一定的影响。不同培养条件下所得包涵体的FT-IR光谱的二阶导数光谱分析表明,随着培养温度的降低,包涵体中所含有的类天然α-螺旋量逐渐增多,包涵体复性率也逐渐提高。随着诱导剂IPTG浓度的降低,包涵体中所含有的类天然α-螺旋量稍稍增多,包涵体复性率略有提高。   考察了不同基因载体对于所表达包涵体结构的影响。结果发现使蛋白周质定位的载体pET-22b表达获得的包涵体所含有的类天然α-螺旋结构所处波数位置为1655.5 cm-1,低于pET-21a和pET-28a表达的包涵体(1657.5 cm-1),表明其二级结构更接近于天然状态。pET-21a和pET-28a载体表达的pcPB包涵体,两者所含有的类天然α-螺旋峰强度相似,所处波数位置都在1657.2cm-1,表明无论在二级结构的量上,还是二级结构与天然结构的相似程度上,两者都没有明显差异。   用扫描电子显微镜观察了温度对于包涵体外形状态的影响。15℃时,虽然能够观察到粒状包涵体,但亚单位之间没有明显的界限,随着温度的升高,亚单位之间的界限逐渐明晰。到37℃时,包涵体已呈现出完全颗粒状态,且有相对平滑的球形外观。   对重组羧肽酶B(recombinant carboxypeptidase B,rCPB)的稳定性进行了研究,分别考察了酶液的稳定性和冻干粉的稳定性。在4℃时,25%甘油的添加对rCPB酶液具有很好的保护作用。3%甘露醇和5%海藻糖在酶液的冻干过程中和冻干粉放置过程中对rCPB都有很好的保护作用。但考虑到冻干粉形态以及复水溶解情况,3%甘露醇更为合适。
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