葛根粗提物及葛根素对人小细胞肺癌H446细胞生长的作用及其机制

• 作 者: 李娟
• 发表日期: 2007年期
• 关键词: 葛根粗提物 葛根素 细胞生长抑制率 凋亡率 细胞周期 PCNA Bax Bel-2 Fas cyclinD1 CDK2 CDK4 P27

我国大别山部分地区发现大量野葛植物生长，资源丰富，并被用于临床，表现出多种药理作用，但是，葛根抗肿瘤作用的研究国外文献未见报道，国内杜德极等人先后研究了葛根提取物对P388白血病、W256癌、EAC腹水瘤、S180肉瘤、H22肝癌的体外抗肿瘤作用以及对EAC腹水瘤、S180肉瘤、Lewis肺癌、H22肝癌的体内抗肿瘤作用，并且采用EAC腹水癌和P388白血病模型试验对葛根提取物组分的体外抗癌活性进行了比较。然而，葛根粗提物（pueraria crude extract，CP）和葛根素（standard of pure puerarin，SP）对人小细胞肺癌H446细胞的作用及其机制研究，尤其以H446肺癌模型试验观察比较CP和SP体外抑瘤作用以及葛根粗提物组分群与药效间的“谱效”研究国内外均未见报道。肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，在我国许多城市已位居全部恶性肿瘤死因的首位。我国多数地区的肺癌发病率和死亡率在过去的20～30年间迅速增长，并将继续保持这一增长趋势，成为严重危害我国人民身体健康的最主要疾病之一。在寻找既具有强大的肿瘤细胞杀伤效应，又对正常细胞不产生明显毒副作用的理想抗肿瘤药物过程中，人们发现，植物药全草及其活性成分是值得深入探索的方向之一。近年来，植物来源的抗肿瘤药引起广泛重视。细胞增殖失控或细胞凋亡受阻都可导致肿瘤的发生，同时，细胞周期调控异常也是细胞增殖失控导致癌变的重要原因。目前，诱导肿瘤细胞凋亡，调控细胞周期运行已成为治疗癌症的一种新思路，并为筛选安全有效的抗癌药提供了新的方向。因此，本课题拟在CP和SP作用H446细胞后，应用显微镜观察、凋亡形态学观察、MTT法、流式细胞术和细胞免疫化学方法等对其细胞形态、纽胞增殖、细胞凋亡和细胞周期等生物学行为，以及与细胞增殖、凋亡和细胞周期相关的蛋白进行研究，了解CP和SP对H446细胞的增殖抑制、凋亡诱导和细胞周期调控的作用，并进一步在蛋白水平阐明其作用机制，从而为CP，和SP应用于临床治疗肿瘤提供理论基础。目的1．探讨葛根粗提物及其主要成份葛根素对H446细胞增殖活力，凋亡率和细胞周期分布的影响，研究CP和SP抑制人小细胞肺癌细胞生长的作用，并对两者的生物学效应进行比较。2．初步探讨葛根粗提物及其主要成分葛根素抑制H446细胞增殖，诱导其凋亡，改变其细胞周期分布的机制。方法1．采用MTT法测定不同浓度CP和SP分别作用24、48、72、96、120小时后，H446细胞生长抑制率。2．利用凋亡细胞形态学检测方法，观察CP和SP引起的H446细胞形态学改变。3．通过流式细胞术分析CP和SP作用于H446细胞后，细胞凋亡率和细胞周期分布情况。4．采用细胞免疫化学方法和流式细胞术检测细胞增殖核抗原，细胞凋亡和细胞周期相关蛋白表达情况。结果1．CP和SP均可不同程度的抑制H446细胞的生长，且呈剂量-效应关系和时间-效应关系。2．相同条件下，CP对H446细胞生长的抑制作用比SP强，差异有统计学意义（P＜0.05）。3．CP和SP作用于H446细胞后，细胞呈现典型凋亡细胞特征，且定量分析表明，细胞凋亡率分别为14.71％和2.61％，CP组凋亡率高于对照组凋亡率，差异具有统计学意义（P＜0.05）。4．细胞周期分布表明：CP和SP作用于H446细胞后，G0／G1期细胞构成比分别为79.20％和72.20％，G2／M期细胞构成比分别为8.94％和10.50％，与对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。5．细胞周期动力学显示，CP和SP作用于H446细胞后，细胞增殖指数减少，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），且CP组细胞增殖指数小于SP组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。6．CP作用于H446细胞后，PCNA蛋白表达量减少，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），而SP作用于H446细胞后，PCNA蛋白表达量与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。7．CP和SP均可使H446细胞Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调，Bax／Bcl-2比值升高，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），且CP作用于H446细胞后，Bax／Bcl-2比值高于SP，差异具有统计学意义（P＜0.05）。8．CP和SP作用于H446细胞后，Fas蛋白表达量均增加，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），且CP使细胞Fas蛋白表达量高于SP，差异具有统计学意义（P＜0.05）。9．CP和SP作用于H446细胞后，CDK₂蛋白表达量减少，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），CP和SP使H446细胞cyclinD₁蛋白和CDK₄蛋白阴性表达，P27蛋白阳性表达，且CP使H446细胞cyclinD₁和CDK₄蛋白的荧光指数低于SP，P27蛋白的荧光指数高于SP，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论1．CP和SP均具有抑制H446细胞生长的作用，且在相同条件下，CP的抑制作用较SP显著。2．CP可以诱导H446细胞凋亡，而SP无此作用。3．CP和SP作用于H446细胞后均延长了G0／G1期，缩短了S期和G2／M期。4．CP可能通过下调PCNA蛋白的表达而抑制H446细胞的增殖。5．CP可能通过调节Bax和Bcl-2蛋白的表达比例而促进H446细胞的凋亡。6．CP可能通过上调Fas蛋白的表达而诱导H446细胞的凋亡。7．CP和SP使H446细胞cyclinD₁、CDK₂和CDK₄蛋白表达下降，P27蛋白表达升高，从而抑制cyclinD-CDK₄、cyclinE-CDK₂复合物的形成，并且P27有效地与cyclinD-CDK₄、cyclinE-CDK₂复合物结合，抑制cyclinD-CDK₂和cyclinE-CDK₂等G1期激酶复合物，阻止细胞通过G1／S期检查点，使细胞阻滞于G1期。