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核酸是在生命活动中扮演重要角色的一类生物大分子,其中一些短片段的核酸近年来受到了广泛关注,如细胞外游离DNA(cfDNA)、微小RNA(microRNA)等。因为这些核酸往往是疾病标志物或治疗的靶点,所以这些核酸的检测具有重要的价值。然而,由于它们往往以较低浓度存在于外泌体、血液或唾液等复杂样品中,因此其检测面临着“能否测得到”和“能否测得准”的问题。为此,本文通过磁分离来消除样品中共存组分的影响,实现待测对象的分离和富集,进而通过核酸信号放大技术提高检测灵敏度,实现了血清、细胞培养液等复杂样品中核酸的高灵敏检测,具体包括:1.基于磁珠辅助的催化发夹组装和“DD-A”FRET信号检测复杂样品中的核酸本方法设计了三条DNA发夹探针,分别是修饰在磁珠上的Capture、双标供体(FAM)的H1和单标受体(TAMRA)的H2。首先,磁珠上的Capture捕获样品中的目标物,同时Capture暴露出一段可以触发CHA的片段;接着,通过磁场的作用即可将目标物分离和富集出来;最后,磁珠被重悬于含有H1和H2的缓冲液中并引发CHA,结果形成大量的H1/H2复合物,从而观察到明显的FRET信号。然而在没有目标物时,就不能引发CHA反应,FRET信号很弱。通过磁珠辅助的CHA和“DD-A”FRET,本方法有效消除了背景干扰,并放大了信号,对microRNA-21的检测限低至34 pM。本方法还可用于检测血清样品和细胞培养液中的microRNA-21,有望用于生物医学研究和临床检测。2.基于染料自淬灭和外切酶III(Exo III)切割的DNA生物条形码技术检测复杂样品中的microRNA在完成上一个工作的过程中发现,如果两个FAM标记在DNA链的相邻位置时,荧光几乎被淬灭,而用酶将DNA链切割后,荧光可提高至原来的10倍以上。基于这一现象,本方法设计了四条DNA探针,分别是修饰在磁珠上的CP、修饰在金纳米颗粒(AuNP)上的辅助探针AP、修饰在AuNP上的HP以及可以与HP互补的SP,其中SP上修饰了两个位置相邻的FAM。首先,磁珠上的CP与样品中的microRNA部分杂交,并通过磁场的作用将microRNA分离和富集出来;接下来,磁珠通过目标物的剩余部分与修饰在AuNP上的AP杂交,形成磁珠-microRNA-AuNP复合物,并通过磁分离将未结合的AuNP除去;最后,利用二硫苏糖醇(DTT)将AuNP上的HP和SP释放到含有Exo III的溶液中;由于酶的切割作用,原本修饰在相邻位置的FAM远离,荧光明显增强。荧光增强的程度与目标物的浓度相关,对microRNA-141的检测限低至69pM,可用于血清样品目标物的检测。本方法无需在DNA链上修饰淬灭基团,具有探针设计简便,信背比高的优点。3.基于染料自淬灭和Exo III循环切割的DNA生物条形码技术检测复杂样品中的microRNA前面两个工作均实现了复杂样品中microRNA的检测,但是其检测灵敏度还有提高的空间。因此引入了Exo III循环切割反应来进一步放大检测信号。本方法设计了四条DNA探针,分别是修饰在磁珠上的CP、修饰在AuNP上的辅助探针AP、修饰在AuNP上的BP以及可以与BP部分互补的发夹探针SP,其中SP上修饰了两个位置相邻的FAM。首先,磁珠上的CP与样品中的microRNA部分杂交,并通过磁场的作用将microRNA分离和富集出来;接下来,磁珠通过目标物的剩余部分与修饰在AuNP上的AP杂交,形成磁珠-microRNA-AuNP复合物,并通过磁分离将未结合的AuNP除去;最后,利用DTT将AuNP上的BP释放到含有SP和Exo III的溶液中;SP的发夹结构打开,引起Exo III的切割,原本相邻的两个FAM远离,荧光得以恢复,而释放出的BP继续参与下一轮酶切。由于引入了一步循环放大,对microRNA-21的检测限低至0.15 pM,也可以用于血清样品和细胞培养液中目标物的检测。