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目的目前矽肺发病机制尚未阐明,其预防和控制是中国职业病防治工作的重要任务之一。普遍认为,在矽尘等多种因素作用下,肺泡Ⅲ型上皮细胞通过上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)转变为肌成纤维细胞,大量增殖并分泌胶原等相关蛋白,是肺纤维化发生发展中重要的生物学事件。以往研究表明,miR-34a-5p 及其靶基因 SMAD4(drosophila mothers against decapentaplegichomolog4)共同参与了肿瘤和肝纤维化等疾病的EMT过程中,可能是EMT过程的重要环节和潜在干预靶点。然而,其在矽肺相关EMT过程中的作用尚未见报道。因此,构建SiO2粉尘诱导的小鼠矽肺模型和体外肺上皮细胞EMT模型,观察miR-34a-5p和SMAD4在其中的存在状况和变化情况,并采用脂质体转染技术对miR-34a-5p和SMAD4进行干预以进一步研究其在EMT中的生物学作用,为深入探索矽肺发病机制提供新的思路和参考依据。方法1.矽肺小鼠EMT过程中miR-34a-5p存在状况实验观察C57BL6/N品系小鼠随机分成不同时间点(包括1天、14天、28天和56天)的实验组及相对应的生理盐水对照组,通过非暴露式气管滴注法滴注50μL SiO2粉尘悬浊液(50mg/mL)或等体积生理盐水的方法建立小鼠矽肺模型。采用肺组织病理切片HE和Masson染色观察小鼠肺组织纤维化病变情况,采用RT-qPCR、Western blot和免疫荧光检测EMT相关的上皮标志物E-cad、间质标志物Vimentin和转分化标志物α-SMA表达水平,同时检测miR-34a-5p和SMAD4表达水平。2.A549细胞EMT模型中miR-34a-5p作用及干预效果实验观察人肺腺癌上皮细胞系A549于RPMI 1640培养基中常规培养,采用5ng/mL TGF-β1 刺激 A549 细胞以构建 EMT 细胞模型。用 miR-34a-5p mimics/inhibitor转染至A549细胞以过表达/抑制miR-34a-5p表达,用siRNA技术沉默SMAD4表达。RT-qPCR、Western blot检测不同处理组EMT相关标志物表达情况,同时检测miR-34a-5p和SMAD4表达水平。双荧光素酶报告基因实验检测miR-34a-5p与SMAD4之间靶向结合关系。3.统计学分析实验数据采用SPSS 21.0进行统计学分析。计量资料采用独立样本t检验和单因素方差分析进行统计分析;检验水准α=0.05。柱状图均由GraphPad 8.0作图软件完成。结果1.矽肺小鼠EMT过程中miR-34a-5p存在状况1.1 SiO2诱导小鼠矽肺模型的构建病理切片HE和Masson染色结果显示,不同时间点相应对照组中肺泡壁结构完整且无细胞结节形成;而在实验组中可见肺泡壁增厚,部分肺泡结构已被破坏同时有细胞结节存在,尤其在第56天实验组小鼠肺组织纤维化程度最为严重。1.2小鼠肺组织中EMT相关基因表达情况RT-qPCR和Western blot检测结果显示,实验组小鼠肺组织中上皮标志物E-cad表达水平下调,而间质标志物α-SMA表达水平上调(P<0.05)。免疫荧光结果也显示纤维化肺组织中E-cad下调。1.3小鼠肺组织中miR-34a-5p和SMAD4表达情况RT-qPCR检测结果显示,实验组小鼠肺组织中miR-34a-5p表达下调,而SMAD4表达上调(P<0.05)。免疫荧光结果显示纤维化肺组织中SMAD4上调。2.A549细胞EMT模型中miR-34a-5p作用及干预效果2.1 TGF-β1诱导体外EMT模型的鉴定和检测情况显微镜下观察到TGF-β1诱导A549细胞后,细胞由铺路石状的典型上皮细胞形态转变成梭型的成纤维细胞样形态。RT-qPCR和Western Blot检测结果显示:TGF-β1刺激后E-cad表达降低,Vimentin和α-SMA表达升高,同时miR-34a-5p表达降低而SMAD4表达升高(P<0.05)。2.2干预miR-34a-5p后EMT相关指标变化情况转染miR-34a-5p mimics明显上调细胞中miR-34a-5p的表达水平。过表达miR-34a-5p下调了SMAD4表达水平。RT-qPCR和Western blot检测结果显示:miR-34a-5p mimics 组与对应 NC 组、miR-34a-5p mimics+TGF-β1 刺激组与TGF-β1刺激组相比,E-cad表达升高,Vimentin和α-SMA表达降低(P<0.05)。转染miR-34a-5p inhibitor明显下调细胞中miR-34a-5p的表达水平。低表达miR-34a-5p上调了 SMAD4表达水平。RT-qPCR和Western blot检测结果显示:miR-34a-5p inhibitor 组与对应 NC 组、miR-34a-5p inhibitor+TGF-β1 刺激组与TGF-β1刺激组相比,E-cad表达降低,Vimentin和α-SMA表达升高(P<0.05)。2.3双荧光素酶报告实验验证miR-34a-5p与SMAD4间结合情况双荧光素酶报告基因实验结果显示:共转染miR-34a-5p mimics和SAMD4-3’UTR野生型质粒的实验组中,双荧光素酶活性显著下降(P<0.05),而共转染miR-34a-5p mimics和SAMD4-3’UTR突变型质粒的实验组中,荧光素酶活性无显著变化。2.4小干扰RNA沉默SMAD4后EMT相关指标变化情况RT-qPCR检测结果显示针对SMAD4设计的三条特异性序列均能够降低SMAD4的表达,其中以siR-3特异性序列沉默效率最高(P<0.05),用于后续实验。RT-qPCR和Western Blot检测结果显示:siR-SMAD4组与阴性对照组、siR-SMAD4+TGF-β1刺激组与TGF-β1刺激组相比,E-cad表达升高,α-SMA和Vimentin 表达降低(P<0.05)。结论小鼠矽肺及肺上皮细胞EMT过程中均伴随有miR-34a-5p表达降低,miR-34a-5p可能通过靶向SMAD4发挥潜在的抑制EMT作用。