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目的：研究迷走神经刺激(VNS)结合电针疗法对条件性线索及小剂量海洛因引燃诱导的大鼠海洛因觅药行为的影响,并通过观察其对信号转导分子的表达的影响揭示其作用的中枢位点和分子生物学机制,为临床抗复吸提供实验依据。
方法：采用固定比率程序(fixed ratio,FR)1建立大鼠海洛因自身给药模型,动物随机分三组：弱迷走神经刺激组、强迷走神经刺激组和手术对照组,每组6只。各组大鼠每天处理1次的后进行环境消退,连续处理10天后,用条件性线索诱导海洛因觅药行为,观察不同电流强度的高频电刺激迷走神经对条件性线索诱导的觅药行为的影响,即观察对有效鼻触、无效鼻触和水平活动度的影响,之后继续处理5天,再以小剂量海洛因引燃,观察不同电流强度的高频电刺激迷走神经对小剂量海洛因引燃诱导海洛因觅药行为的影响。用Western blotting方法检测不同强度高频电刺激迷走神经对伏隔核(NAc)、前额皮层(PFC)等相关脑区△FosB、p-CREB、p-AKT、p-ERK等蛋白表达的影响。
在建立上述大鼠自身给药复吸模型实验基础上,环境消退的同时给予高频弱电迷走神经刺激结合低频弱电针连续处理10天,观察它们对自身给药行为消退后再由条件线索和小剂量海洛因引燃诱导的觅药行为的影响。然后采用Western blotting方法检测上述各脑区相关蛋白的表达。
结果：
实验一、迷走神经刺激对线索和海洛因诱导的觅药行为的影响及其分子生物学机制。
1.迷走神经刺激对线索和海洛因觅药行为的影响。
经过处理后,弱VNS组和强VNS组大鼠由条件线索诱导的有效鼻触数较手术对照组均明显减少,差异具有显著性(P=0.03,P=0.01),各组的无效鼻触数均无显著性差异(P>0.05)。小剂量海洛因引燃大鼠觅药行为测试：弱VNS和强VNS组大鼠在小剂量海洛因引燃时有效鼻触数较手术对照组的均明显减少,具有显著性统计学意义(P=0.009,P=0.019)。而且,强VNS无效鼻触数与手术对照组相比显著减少(P=0.024)。
强VNS组在消退第二小时内大鼠自由活动度较手术对照组明显减少(P=0.046)。
2.迷走神经刺激对大鼠中枢部位△fosB等信号转导蛋白表达的影响。
应用Western blotting法检测发现：弱VNS组和强VNS组大鼠VTA、NAc、CPU中△fosB均较手术对照组明显减少(P<0.05)。弱VNS组和强VNS组大鼠PFC、NTS和BST中△fosB的表达均较对照组显著增加(P<0.05)。而Hipp、Amyg 中△fosB表达在各组的间无显著性差异。
弱VNS组p-CREB在VTA中表达较手术对照组显著增高(P<0.05),弱VNS组和强VNS组大鼠p-CREB在NAc中的表达均较手术对照组显著增高(P<0.05),而强、弱VNS组大鼠p-CREB在Amyg、BST中的表达较对照组均显著减少(P<0.01)。强VNS处理组大鼠p-CREB在PFC和CPU表达较对照组减少(P<0.05)。弱VNS处理组p-CREB在Hipp中较对照组表达增多,强VNS则减少差异均具显著性(P<0.01)。
弱VNS组和强VNS组大鼠p-ERK在NAc、PFC、CPU和Amyg中表达均较手术对照组明显减少(均为P<0.05),强VNS组p-ERK在BST中表达较手术对照组显著减少(P=0.002)。
弱VNS组和强VNS组p-AKT表达在NAc中较手术对照组明显增加,差异具有显著的统计学意义(P=0.002,0.008)。而弱VNS组p-AKT在NTS中表达较手术对照组明显减少(P=0.002)。
实验二、迷走神经刺激结合电针对条件线索和海洛因引燃诱导的觅药行为的影响及其分子生物学机制。
1.迷走神经弱刺激结合低频弱电针协同抑制条件线索和海洛因诱导的觅药行为迷走神经弱刺激结合低频弱电针处理后条件线索诱导的有效鼻触数与电针对照组及VNS组相比显著减少(P=0.019,P=0.006)。该组由小剂量海洛因引燃诱导的有效鼻触数也较电针对照组或VNS组大鼠明显减少(P=0.000,P=0.046)。迷走神经弱刺激结合低频弱电针处理后大鼠自由活动度较VNS组处理组显著增多(P=0.032)。而各组间无效鼻触均无显著性差异(P>0.05)。
2.迷走神经弱刺激结合低频弱电针处理对大鼠相关脑区△fosB等信号转导蛋白表达的影响。
大鼠经过迷走神经弱刺激结合低频弱电针处理后△fosB在NAc中表达较电针对照组和VNS组显著减少(P=0.000,P=0.001)。该组CPU中△fosB的表达较电针对照组显著减少(P=0.001)。该组NTS中的表达较与电针对照组和VNS组均显著增加(P=0.000,0.000)。在迷走神经弱刺激结合电针处理组的PFC、BST中△fosB表达较电针对照组显著增多(P=0.000,0.016)。经过迷走神经弱刺激结合低频弱电针处理后大鼠VTA、NAc、Amyg和Hipp中p-CREB表达均较电针对照组对照组显著增多(P<0.01),较VNS对照组明显增多(P<0.05)。迷走神经刺激结合电针组PFC中p-CREB较电针对照组和VNS组显著减少(P<0.01)。
大鼠经过迷走神经弱刺激结合低频弱电针处理后p-ERK在NAc和BST中表达较电针对照组和VNS组均显著减少(P<0.05),在Amyg中较电针对照组减少(P=0.015)。而经过迷走神经弱刺激结合低频弱电针处理后p-AKT在NAc中表达增加(P=0.020)。
结论：
1.本研究发现迷走神经刺激能抑制条件性线索和海洛因诱导的大鼠觅药行为。
2.电针可以协同迷走神经刺激处理大鼠海洛因的觅药行为,增强大鼠的活动度。
3.迷走神经刺激结合电针减少海洛因觅药行为的部分机制可能是通过调节一些脑区△FosB、p-CREB、p-ERK、p-AKT蛋白表达以激活上行通路和强化前额皮层功能,从而减弱VTA-NAc奖赏通路的长时程适应。
4.迷走神经刺激和电针对觅药行为抑制的协同作用和信号转导蛋白表达提示两者抑制海洛因觅药行为可能具有不同的作用途径。